Stable cell line 만드는 목적

타깃 유전자 기능을 연구하기 위해서 타깃 유전자 단백질을 과발현하는 기술이 필요합니다. Transfection [노트 1]을 통해 타깃 유전자 단백질의 과발현을 할 수 있습니다. 하지만 transiently-transfection을 한 유전자 단백질 발현은 일시적입니다. 따라서 짧은 기간의 연구에서는 transiently-transfection을 사용할 수 있지만, 오랜 기간 연구가 필요한 곳에서는 transiently-transfection이 적합하지 않습니다. 따라서 타깃 유전자 단백질의 오랜 기간 연구에 필요한 방법이 필요합니다.

이번 글에서는 타깃 유전자 단백질의 오랜 기간 연구와 transiently-transfection 보다 배양하는 동안 유전적으로 단백질 발현이 일정해서 약물치료의 평가와 나아가 세포 행동의 진화를 확인할 수 있는 stable cell line을 만드는 방법을 소개하겠습니다. Stable cell line을 만들기 위해서는 바이러스 (Adenovirus, AAV, Lentivirus, Retrovirus)를 이용하는데 여기에서는 transient 혹은 stable에 사용 가능한 Lentivirus를 이용하는 방법을 소개합니다. Transduction [노트 2]을 위해서 바이러스의 생산과 감염 두 단계로 나누는데, 바이러스 생산에 특화된 HEK293T (Human embryonic kidney cells)를 사용하여 바이러스를 생산하고, 여기에서 만들어진 바이러스를 정제하여 transduction 할 세포에 감염시킴으로써 유전자의 도입을 수행합니다 [그림 1].

그림 1. Viral Production Schematic (출처: https://www.addgene.org/guides/lentivirus/)

Stable cell line 만드는 방법

HEK293T가 plate에 잘 붙게 하도록 15 cm plate에 0.1% 젤라틴 (gelatin) 20 ml를 넣은 다음 37도에서 3시간 혹은 오버나잇 (overnight)으로 처리합니다. Plate가 코팅되면 HEK293T을 다음 날 대략 cell이 plate의 70% 정도 되게 cell을 넣습니다 [노트 3]. 70% 정도 자란 cell에 타깃 유전자 단백질을 발현할 수 있는 Transfer Vector (G418 selection), Packaging Vector, Envelope Vector를 transfection 합니다 [그림 1]. 이때 타깃 유전자 단백질이 없는 Empty Vector를 사용하여 negative control로 사용합니다 [그림 2B]. Transfection을 한 다음 날 cell 미디어를 15 ml Virus growth medium (V-GM)으로 바꾸어 줍니다. 이날 stable cell line을 만들기 원하는 cell을 10 cm plate에 키웁니다 [그림 2A]. 여기에서는 HeLa (Human Epithelium) cell을 이용합니다.

V-GM으로 바꾼 다음 날 V-GM을 필터를 이용하여 50 ml tube에 옮기고, V-GM을 제거한 HEK293T plate에 새로운 V-GM 15 ml를 넣고 37도에 보관합니다. 필터 한 V-GM 5 ml을 전날에 준비한  HeLa plate에 넣고 추가로 mammalian cells에서 lentiviral infection의 효율을 높이는 polybrene을 넣어 줍니다. 다음 날 전날과 같은 방법으로 V-GM을 필터를 이용하여 50 ml 튜브에 옮기고, transduced HeLa plate에 5 ml을 넣고 polybrene을 첨가합니다. 다음 날  transduced 하지 않은 HeLa cell을  G418 (antibiotic selection) control로 사용하기 위해 키웁니다. Transduced를 하고 이틀 뒤에 transduced HeLa plate에 G418을 이용하여 cell을 selection 합니다. 이때 transduced를 하지 않은 HeLa plate에도 G418을 처리하여 selection control로 사용합니다 [그림 2A]. G418을 처리하고 3일 후에 다시 G418을 처리합니다. Selection은 첫 G418을 처리하고 일주일 정도 걸립니다 [그림 2A].    

그림 2. Stable cell line 만드는 과정 (출처: 본인) A. 작업 흐름 (Workflow). B. Stable cell line 웨스턴 블랏 결과 [노트 4]. HA antibody를 이용하여 과발현 단백질을 확인할 수 있습니다. Lane 1: Empty Vector. Lane 2: 타깃 유전자 단백질

Stable cell line 확인

G418 selection을 통해 transduction 이 되지 않은 cell은 살지 못합니다. Selection이 끝나면 웨스턴 블랏 (Western blot)을 이용하여 만든 stable cell line에서 타깃 유전자 단백질 발현을 확인합니다. 위에서도 언급했듯이 타깃 유전자 단백질을 포함하는 플라스미드와는 별도로 타깃 유전자 단백질이 없는 Empty Vector를 사용하여 stable cell line을 만들어서 negative control로 사용합니다 [그림 2B]. 예상되는 웨스턴 블랏 결과는 Empty Vector를 이용하여 만든 stable cell line에서는 타깃 유전자 단백질 발현되지 않고, 타깃 유전자 단백질이 포함된 플라즈미드로 만든 stable cell line에서만 단백질이 발현됩니다 [노트 5].

노트

1. Transfection: mammalian cell에 타깃 유전자 기능에 대한 연구 목적으로 non-viral DNA 혹은 RNA를 세포에 도입하는 것으로 연재 5 [출처 1]에 소개했던 유전자의 과발현이나 감소에 대해 실험을 할 때 많이 사용하는 연구 방법입니다.
2. Transduction: viral DNA를 세포에 도입하는 것으로, 바이러스 혹은 viral vector를 사용하여 동물 세포에 유전자를 도입합니다.
3. 개인적인 실험 경험을 바탕으론 HEK293T가 다음 날 plate의 70%에 되게 하기 위해서 cell을 1:2.7로 희석합니다.
4. Endogenous 유전자 단백질과 타깃 유전자 과발현 단백질과 구별하기 위해서, transfer vector에 FLAG와 HA 태그를 넣습니다. FLAG와 HA를 넣음으로써 추가로 IP (Immunoprecipitation)를 비롯한 다른 목적의 실험들도 할 수 있습니다.
5. 타깃 유전자 단백질 발현이 적을 경우에는 필터로 모은 V-GM을 lenti-X concentrator랑 잘 섞어서 centrifuge를 통해 펠릿 (pellet)을 모읍니다. 이 모은 펠릿을 V-GM에 풀어서 사용하면 타깃 유전자 단백질 발현이 강한 stable cell line을 만들 수 있습니다.

출처

1. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=334787&Page=1