다양한 스토리를 담고 있는 연재를 만나보세요.
[실전 실험 프로토콜 101] #4. 꼬리에 꼬리를 물고…(원형 RNA)
Bio통신원(세오)
단 한 번의 PCR를 통해 타깃 유전자에서 여러 아이소폼(isoform)을 찾아내는 방법 (MESDA)을 첫 번째 편에서 소개를 했고 [출처1], MESDA를 이용하던 중 타깃 유전자의 intronic Alu-like 시퀀스에서 만들어진 새로운 엑손 (exon)을 발견한 내용을 두 번째 이야기에서 소개를 했습니다 [출처2].
그림 1. RNA family
(출처: https://wi.mit.edu/news/intro-rna-biology-cartoon-edition)
원형 RNA (circular RNA)
인트론 (intron) 혹은 엑손으로 구성된 원형 RNA는 진핵세포에 광범위하게 존재하는데, 처음에는 원형 RNA가 발현이 낮고 기능이 거의 없는 스플라이싱 (splicing)의 부산물로서, 전사(transcription) 후 처리 과정에서 발생한 오류라고 간주하였습니다. 하지만, 최근 원형 RNA와 관련된 여러 연구를 통해 원형 RNA의 다양한 기능들이 밝혀지면서 그 잠재적인 역할에 주목받고 있습니다.
대표적으로 알려진 원형 RNA의 기능은 microRNA 스펀지와 RBP (RNA 결합 단백질)의 결합입니다. 선형 RNA (linear RNA)와 달리 원형 RNA는 양 말단이 없는 원의 구조로 되어 있어서 상대적으로 안정적인 구조로 되어 있지만, 선형 RNA보다 원형 RNA의 발현량이 적습니다. 원형 RNA가 만들어지는 방법의 하나로 RNA:RNA 듀플렉스를 형성할 수 있는 역방향 Alu 반복이 5' 스플라이스 사이트 (splice site)와 3' 스플라이스 사이트가 서로 가까이하여 back-splicing을 통해 원형 RNA 생성을 촉진합니다 (그림 2A). 유전자가 Alu 시퀀스를 포함하고 있으면 원형 RNA를 만들 수 있다는 사실을 바탕으로 타깃 유전자 (Survival Motor Neuron, SMN)를 이용하여 실험을 했습니다 [노트 1].
그림 2. 원형 RNA의 생성과 측정. A) 타깃 유전자의 pre-mRNA에서 선형 RNA 혹은 원형 RNA. B) 원형 RNA 측정을 위한 프라이머 (primer) 디자인.
원형 RNA 측정 방법
Pre-mRNA는 스플라이싱을 통해 선형 RNA 혹은 원형 RNA로 만들 수 있습니다 (그림 2A). 원형 RNA를 확인하기 위해 total RNA를 뽑고, 선형 RNA를 없애기 위해 RNase R [노트 2]을 처리합니다. RNase R을 처리한 RNA를 이용하여 cDNA를 만듭니다. 이때, RNase R을 처리하지 않은 RNA를 이용하여 컨트롤 cDNA를 같이 만듭니다. RNase R을 처리한 cDNA 와 RNase R을 처리하지 않은 cDNA를 같이 사용해서 타깃 유전자에서 만들어진 원형 RNA를 확인할 수 있습니다. 두 개의 프라이머가 한 엑손에서 마주 보지 않게 바깥 방향으로 디자인합니다 (그림 2B).
이렇게 프라이머를 디자인해서 PCR를 하면 선형 RNA는 측정되지 않고, 원형 RNA 만 측정할 수 있습니다. 예상되는 PCR 밴드를 클로닝 (cloning) 과 시퀀싱 (sequencing)을 통해서 확인합니다. PCR 밴드를 클로닝을 해서 시퀀싱을 확인하는 방법은 세 번째 편에 소개하였습니다 [출처 3]. 이렇게 타깃 유전자 (SMN)에서 찾은 원형 RNA가 50여 개 입니다 [출처 4]. 타깃 유전자 (SMN)의 pre-mRNA가 선형 RNA와 원형 RNA를 만든다는 사실이 흥미롭습니다. 이와 관련하여 SMN 유전자가 원형 RNA를 생성할 수 있음을 2018년 6월 13일에 저널에 제출을 했고, 2019년 1월 14일에 승인되었습니다 [출처 4]. 다른 연구그룹에서도 SMN 유전자가 원형 RNA를 만든다는 사실을 2019년 3월 22일에 논문을 제출해서 같은 해 11월 22일에 승인이 되었습니다 [출처 5].
해결해야 할 일들
아직 타깃 유전자 (SMN)의 pre-mRNA가 선형 RNA와 원형 RNA를 몇 대 몇으로 만드는지에 대해서는 잘 모릅니다. 또한, 타깃 유전자 (SMN)의 원형 RNA가 생체 내에서 어떤 기능을 하는지 밝혀지지 않았습니다. 타깃 유전자 (SMN)의 원형 RNA를 과발현 (overexpression) 시키거나, 낙다운 (knockdown) 시켜서 세포 내에서 어떤 역할을 하는지에 대한 추가적인 연구가 필요합니다. 다음 편에서는 원형 RNA를 과발현 혹은 감소시키는 방법에 대해 알아보겠습니다.
출처
노트
본 기사는 네티즌에 의해 작성되었거나 기관에서 작성된 보도자료로, BRIC의 입장이 아님을 밝힙니다. 또한 내용 중 개인에게 중요하다고 생각되는 부분은 사실확인을 꼭 하시기 바랍니다.
[기사 오류 신고하기]
논문에 나온 실험을 따라서 하고 싶어도 논문에 실험 절차가 너무 간략하게 소개되어 있거나, 자세한 설명이 없어서 실험을 따라 하기가 어려운 경우가 종종 있습니다. 이럴 경우 '같은 실험실 혹은 주위 실험실에서 실제로 유사한 실험을 한 사람의 실험 노트가 있다면 얼마나 좋을까?' 라고 자주 생각했습니다. 이번 연재를 통해 제가 실험실에서 배운 내용을 같거나 비슷한 분야에서 연구하는 분들과 나누고자 합니다. 물론 제가 소개하는 내용이 최고라고 생각하지 않고, 소개하는 내용보다 더 좋은 실험 방법이 있다고 생각합니다. 이러한 자신만이 알고 있는 실험 방법을 공유하여 주시면, 같은 길을 걷고 있는 분들에게 도움이 되리라 생각합니다.
다른 연재기사 보기
전체 보기