연재를 시작하며…

논문에 나온 실험을 따라서 하고 싶어도 논문에 실험 절차가 너무 간략하게 소개되어 있거나,  자세한 설명이 없어서 실험을 따라 하기가 어려운 경우가 종종 있습니다. 이럴 경우

'같은 실험실 혹은 주위 실험실에서 실제로 유사한 실험을 한 사람의 실험 노트가 있다면 얼마나 좋을까?'

라고 자주 생각합니다. 또한 실험에 대한 배경지식 없이 단순히 실험 방법을 따라 하면, 어느 정도의 결과를 낼 수 있지만 뜻하지 않은 어려움에 부딪혔을 때 그 원리를 알지 못하면 문제 해결을 못 하거나, 해결하더라도 그 문제를 해결하는 데에 많은 시간을 보내야 합니다. 이번 연재를 통해 제가 실험실에서 배운 내용을 같거나 비슷한 분야에서 연구하는 분들과 나누고자 합니다. 이렇게 함으로써 같은 실험을 하더라도 실험 비용은 저렴하고, 좋은 질의 실험 결과물을 얻는 데에 도움이 되리라 생각합니다. 거기다 난관에 부딪혔을 때 문제 해결하는 시간도 절약할 수 있을 것 같습니다. 물론 제가 소개하는 내용이 최고이거나 최선이라고 생각하지 않습니다. 소개하는 내용보다 더 좋은 실험 방법이 있다고 생각합니다. 이러한 자신만이 알고 있는 실험 방법을 댓글로 남겨서 같이 공유하여 주시면, 같은 길을 걷고 있는 분들에게 도움이 되리라 생각합니다.  

한 번의 PCR로 여러 개의 isoform을 찾아내는 방법

요즘 코로나 검사에 이용되는 검사 종류 중 하나인 PCR (Polymerase Chain Reaction) 검사 때문에 PCR이라는 단어가 아주 익숙해져 있습니다. PCR은 아주 적은 DNA의 양으로 이미 알고 있는 DNA 염기서열의 특정 부분을 증폭할 수 있는 생명공학 기술입니다. 예를 들어, 실험을 통해 특정 약물을 처리했을 때 타깃 유전자 (gene)의  발현을 측정하고자 할 때 그 유전자에 결합하는 프라이머 (primer)를 디자인하여 PCR를 하면 타깃 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있습니다. 또한 그 타깃 유전자의 발현량을  QPCR (quantitative PCR)를 사용하여 측정할 수 있습니다. 하지만, 우리가 알고자 하는 유전자가 엑손 (exon) 스플라이싱 (splicing)을 통해 여러 가지 단백질로 발현된다면 어떻게 해야 할까요?

오늘날 알려진 많은 유전자는 하나 이상의 아이소폼 (isoform)을 만들고 각각의 아이소폼은 그에 해당하는 단백질을 만드는데, 알려진 바에 의하면 사람의 유전자의 95%가 엑손 스플라이싱을 통해 여러 가지 형태의 아이소폼을 만듭니다. 이러한 이유로 하나의 단일 유전자에서 구조와 구성이 다른 여러 단백질을 만들 수 있습니다. 즉, 하나의 유전자가 여러 개의 단백질을 만들 수 있습니다. 그럼 하나의 유전자에서 만들어지는 여러 개의 isoform을 어떻게 확인할 수 있을까요? QPCR를 이용할 경우에는 측정할 수 있는 유전자의 길이 (70 bp-200 bp)가 PCR보다 제한적입니다. QPCR를 이용할 경우 먼저 알려진 아이소폼들의 프라이머를 개별적으로 각각 따로 디자인해야 합니다. 이 부분에 대해서는 아래에서 조금 더 자세히 설명하겠습니다. 다시 말해, 프라이머 세트당 하나의 유전자의 발현량을 측정할 수 있습니다. 하지만, 알려지지 않은 유전자의 아이소폼의 경우에는 프라이머를 디자인할 수 없어서 QPCR로 측정하는 것이 어렵습니다.

대체안으로, 요즘 많이 쓰고 있는 RNA-Seq 을 이용해서 타깃 유전자의 어떤 엑손이 포함되고 포함되지 않는 것을 먼저 알아보고, 그에 해당하는 프라이머를 디자인하여 QPCR 실험을 통해 확인하는 방법이 있습니다. 예를 들어, 엑손이 1에서부터 엑손 8까지 있는 유전자에서, 엑손 3 스킵핑 (skipping)이 일어난 경우 어떻게 하면 이 이소폼의 발현을 확인할 수 있을까요? 그림 1에서 보는 것처럼 5′ 프라이머를 엑손 2와 엑손 4에 걸쳐서 디자인 (F4) 하고, 3′ 프라이머를 엑손 4 (R4) 위치하게 디자인하면 엑손 3번이 스킵핑한 아이소폼을 QPCR를 통해 확인할 수 있습니다. 그림 1에는 표시하진 않았지만, 5′ 프라이머를 엑손 2에 위치하고, 3′ 프라이머를 엑손 2와 엑손 4에 걸쳐서 디자인해도 엑손 3번이 스킵핑하는 아이소폼을 확인 할 수 있습니다. 지금까지 엑손 3번이 스킵핑한 아이소폼을 확인 할 수 있는 2가지 다른 프라이머 디자인하는 방법을 알아보았습니다. 이때 QPCR 결과를 해석할 때 주의를 해야 하는 부분이 있습니다. 이 QPCR 결과는 엑손 3번만 빠진 아이소품 (Δ3)뿐만 아니라, 스킵핑 엑손 3, 5 (Δ3, 5) 혹은 Δ3, 7, 혹은 Δ3, 5, 7의 아이소폼 모두를 포함합니다.   

그림1. 엑손 1에서 엑손 8까지 있는 유전자에서 엑손 스플라이싱으로 생기는 아이소폼의 발현량을 측정하기 위한 QPCR 프라이머 디자인 방법입니다. 타원형은 스킵핑 (skipping) 엑손으로 이미 알려졌고, 사각형은 스킵핑 하지 않는다고 알려진 엑손입니다. F: forward (정방향), R: reverse (역방향), E: exon (엑손). 화살표는 프라이머의 방향과 프라이머가 위치한 곳을 나타냅니다. 예를 들어, R1 프라이머는 엑손 1과 엑손 2에 걸쳐서 존재하고, F4 프라이머는 엑손 2b와 엑손 4를 걸쳐서 위치합니다. F4에서 엑손 3을 건너뛰는 것을 점선으로 표시했습니다. [출처 1에서 가지고 옴, 노트 1].

다시 말해, F4와 R4의 프라이머로 디자인한 QPCR 결과는 [Δ3], [Δ3, 5], [Δ3, 7], [Δ3, 5, 7]의 4개의 아이소폼들의 발현을 측정한 값입니다. 여기에 더해서 엑손 5가 스킵핑한 아이소폼 (Δ5)의 발현량을 알아보기 위해서는 그에 맞는 새로운 프라이머들을 디자인해야 하고, QPCR 결과의 해석 시에도 위에서 설명한 것처럼 다른 엑손 스킵핑과의 컴비네이션 아이소폼들 ([Δ3, 5], [Δ5, 7], [Δ3, 5, 7])과 관련해서 주의 깊게 해석을 해야 합니다. 하나의 유전에서 만들어지는 여러 개의 아이소폼들의 발현량을 측정하는 방법으로 QPCR을 이용하는 것을 여러 가지 문제가 생길 수 있음을 알아보았습니다. 이러한 문제들을 극복할 방법에 대해 지금부터 알아보겠습니다. 그림 1에서 봤듯이 타깃 유전자의 엑손 3, 엑손 5, 그리고 엑손 7번이 스킵핑이 된다고 알려졌습니다. 그래서 PCR 프라이머를 디자인할 때 5′ 프라이머는 엑손 3번의 바로 전인 엑손 2b에 3′ 프라이머는 엑손 7번 바로 다음 엑손 8번에 위치하게 디자인 (Multi-Exon-Skipping Detection Assay, MESDA)을 하고 여러 가지 다양한 세포 셀라인에서 만든 cDNA (complementary DNA)를 템플레이 (template)로 하여 PCR을 했습니다. 

그림 2. 다른 세포 라인들에서 타깃 유전자 (SMN1 과 SMN2; 유전자인 경우 이탤릭체로 표시)의 여러 가지 아이소폼들 (여러 엑손 스킵핑 이벤트)을 세포 라인당 단 한 번의 PCR (MESDA)로 측정한 젤 사진입니다. PCR을 위해 엑손 2b와 엑손 8에 위치한 프라이머 세트를 사용했습니다. 젤 그림의 왼쪽에는 아이소폼들과 젤 그림의 오른쪽에는 거기에 해당하는 크기를 나타냈었습니다. 이 실험을 통해 새롭게 발견한 아이소폼은 별 표시로 나타내었습니다 [노트 2]. NS: non-specific, FL: full-length [출처 2에서 수정]. 

그림 2에서 보듯이 SMN1  혹은 SMN2를 각각 하나씩만 가지고 있는 세포들과 SMN1과 SMN2를 모두 가지고 있는 세포 라인들의 타깃 유전자의 아이소폼들 발현 패턴이 다름을 보여주고 있습니다. 또한 SMN1과 SMN2를 모두 가지고 있는 세포 라인일 경우에도 세포 라인을 얻은 위치에 따라 아이소폼들의 발현 패턴이 다름을 보여줍니다. 예를 들어, 뉴런 셀일 경우와 뉴런 셀이 아닐 때도 아이소폼들의 발현 패턴이 달랐습니다. 나중에 5′ 프라이머를 엑손 2b가 아닌 엑손 1에 위치하게 하고 엑손 8 프라이머와 PCR를 해도 실험이 잘 진행되었습니다. 

단 한 번의 PCR로 한 유전자에서 여러 가지 아이소폼의 발현을 측정하는 방법을 MESDA (Multi-Exon-Skipping Detection Assay)로 이름을 붙였습니다. 이 방법은 5′ 프라이머를 첫 번째 엑손에 3′ 프라이머를 마지막 엑손에 위치하게 디자인을 한 다음 PCR을 통해서 원하는 타깃 유전자의 아이소폼 발현을 확인할 수 있습니다. 만약 첫 번째 엑손과 마지막 엑손에 위치한 프라이머 세트를 이용한 PCR이 잘 안된 경우, 마지막 엑손에 위치한 3′ 프라이머를 고정하고, 5′ 프라이머의 위치를 마지막 엑손의 가까운 곳에서부터 점점 멀어지는 방향으로 프라이머를 디자인하여 PCR를 테스트하면 됩니다. 다음 글에서는 MESDA를 이용하여 실험하던 중 타깃 유전자에서 예상치 않게 새로운 엑손을 발견해서 논문을 출판한 이야기에 관해 이야기를 나누어보겠습니다.   

출처

1. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0154390
2. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0049595