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유전자가위 활용하여 간암 정밀진단 해법 찾았다
의학약학 한국생명공학연구원 (2021-01-06)

정밀진단용 무당쇄항체 생산 마우스 개발·체외진단 원천기술 확보


국내연구진이 차세대 유전자 가위 기술인 CRISPR-Cas9과 아데닌염기편집기(Adenine base editor)를 이용하여 정밀진단용 무당쇄항체 생산 마우스를 개발하였다. 무당쇄항체를 적용한 정밀진단 플랫폼의 개발은 향후 다양한 질병 바이오마커 발굴 및 암의 조기진단을 촉진하고 효과적인 치료를 가능케 할 것으로 기대된다.
   ※ 무당쇄항체 : 단백질에 결합된 당은 생명현상을 유지하기 위해 중요한 역할을 담당하고 있다. 무당쇄항체는 기존 항체 단백질에 결합되어 있는 당이 제거된 항체를 말한다. 항체에 결합된 당은 생체면역반응에는 필수적이나 진단용으로는 적합하지 않다.
 

한국생명공학연구원 김용삼 박사

<한국생명공학연구원 김용삼 박사>


한국생명공학연구원(생명연) 유전자교정연구센터 김용삼 박사팀(교신저자: 김용삼, 고정헌 박사, 제1저자: 이난이/김선희 연구원)이 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 바이오의료기술개발사업 및 국가과학기술연구회가 추진하는 창의형 융합연구사업(CAP) 및 생명연 주요사업의 지원으로 수행되었고, 생물학 분야의 네이처 자매지인 커뮤니케이션스 바이올로지(Communications biology) 10월 30일자(한국시각 10월 31일) 온라인 판에 게재되었다.
(논문명 : Aglycosylated antibody-producing mice for aglycosylated antibody-lectin coupled immunoassay for the quantification of tumor markers (ALIQUAT))

현재 임상진단분야에서는 항체를 이용한 면역분석법을 통해 질병체외진단키트들이 널리 사용되고 있다. 특히 단백질 바이오마커들의 비정상적인 당쇄구조는 암 진단에 그 임상유효성이 검증되어 있다.

특정 당쇄에 특이적으로 결합하는 렉틴(lectin)을 항체와 함께 사용하면 당단백질의 당쇄구조 차이를 정확히 구별하여 간암을 보다 정밀하게 진단이 가능할 수 있다. 그러나 기존의 항체는 공통적으로 당단백질로써 렉틴과 교차반응이 일어나 분석이 어려웠다.

이러한 문제를 해결하기 위하여 교차반응을 일으키지 않도록 당을 포함하지 않는 무당쇄항체 제작이 필요한 상황이었다. 이전의 연구들은 효소나 화학적 방법을 이용하여 무당쇄항체를 제작하였으나, 반응 효율이 완전하지 못할 뿐 아니라 최종 무당쇄항체의 회수율도 낮다는 한계를 보여왔다.

연구팀은 무당쇄항체 생산 마우스를 제작하여 기존의 한계를 근본적으로 극복하고, 차세대 정밀진단 플랫폼을 개발하였다. 유전자가위기술을 기반으로 항체 유전자를 교정한 마우스를 제작함으로써 무당쇄항체 생산 시스템을 구축하였다.

종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법은 바이오마커의 특정 당쇄구조를 특이적으로 구분함으로써 간암 여부를 정확하게 진단하였다.

연구팀은 확보된 무당쇄항체 생산용 마우스로부터 간암 바이오마커*에 대한 단일클론항체를 제작하였고 이를 간암진단에 적용한 결과 기존의 당쇄항체와 비교하여 월등한 간암 정밀진단 능력을 보였다.
     * 인간알파태아단백질(human alpha-fetoprotein, hAFP)

연구책임자인 김용삼 박사는 “동 연구 성과는 다양한 질병 바이오마커 연구에 기여할 것이고, 강력한 정밀진단 플랫폼을 제공 할 수 있음을 시사하는 것”이라며, “이 정밀진단 플랫폼은 암의 조기진단을 촉진하고 효과적인 치료를 가능케 할 것이다.”라고 밝혔다.

연   구   결   과   개   요

□ 연구배경
○ 비정상적인 당질화는 암과 같은 다양한 질병과 밀접한 관련이 있다. 실제로 FDA에서 승인된 암바이오마커의 상당 부분이 당단백질이다. 이러한 미세한 당쇄구조의 차이는 정밀한 체외진단을 위한 분석 대상이 될 수 있다.
○ 알파태아단백(α-fetoprotein, AFP)은 간암(Hepatocellular carcinoma, HCC)세포에서 과발현되는 대표적인 바이오마커이다. 그러나 혈중 AFP 농도는 간암 외에 감염, 간경변, 임신 등의 경우에도 증가 할 수 있으며 높은 위양성 비율로 인해 조기진단에는 어려움이 있다. 이에 반해, 코어 퓨코실화 형태의 AFP (core-fucosylated AFP, AFP-L3)는 간암 초기부터 전체 AFP 중 10%이상의AFP-L3가 특이적으로 검출된다.
○ FDA 승인을 받고 임상에 사용되고 있는 일본 W사 제품의 경우 AFP-L3의 비율을 분석하는 자동화시스템으로 상대적으로 분석비용이 비싸다. 또한 AFP 이외의 바이오마커를 적용하기엔 많은 시간과 비용이 투자되는 연구가 필요하다. 반면에 항체를 이용한 효소결합면역흡착분석법(ELISA)이나 화학발광면역분석법(CLIA)과 같은 면역분석법 플랫폼은 비교적 적은 비용이 소요되며, 간단한 실험으로 새로운 바이오마커 연구와 분석에 대한 접근성이 용이하다.
○ 바이오마커를 특이적으로 포획하는 항체를 사용한 면역분석 플랫폼에 특정 당쇄구조에 특이적으로 결합하는 렉틴(lectin)을 함께 적용할 수 있다면 미세한 당쇄구조의 차이를 구별해낼 수 있다. 그러나 기존의 항체는 모두 중쇄 불변영역에 N-당쇄구조를 포함하는 당단백질로써 렉틴과 결합하여 면역분석이 근본적으로 불가능하다. 기존의 연구들은 효소나 화학적인 처리를 통해 문제의 당쇄를 제거하고자 하였으나, 그 처리과정이 번거롭고 반응결과가 완전하지 못할 뿐 아니라 추가적인 정제 단계에서의 손실 또한 상당하다는 한계를 보였다.
 
□ 연구내용
○ 연구팀은 항체 생산에 주로 사용되고 있는 마우스의 항체 유전자(Ighg) 중 N-당쇄가 만들어지는 아스파라진 코딩 코돈을 다른 아미노산 코딩 코돈 서열로 교정함으로써, 무당쇄항체 생산용 마우스를 제작하고자 하였다.
○ CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 상동재조합(HDR)방법과 아데닌염기편집방법을 마우스 수정란에 적용함으로써 면역분석 플랫폼에 사용되는 항체인 IgG를 모두 무당쇄항체로 생산하는 마우스를 제작하였으며, 이 마우스를 이용하여 간암 바이오마커인 hAFP에 대한 무당쇄항체를 생산하였다.
○ 시험관내 조건하에서 무당쇄항체는 기존 당쇄항체와 비교하여 동등한 높은 안정성을 유지하며, AFP-L3 구별능력은 월등하다는 것을 입증하였다.
○ 종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법 (aglycosylated antibody-lectin coupled immunoassay for the quantification of tumor markers, ALIQUAT)을 간암 진단을 위한 AFP-L3 분석에 적용하였을 때, 상용중인 일본 W사 제품의 분석결과와 유사한 결과를 확인하였다.
○ 즉, 본 연구의 성과는 체외진단 조건하에서 안정성이 보장되는 무당쇄항체 생산 시스템을 구축한 것이다. 더 나아가 종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법을 개발하고 강력한 정밀진단 플랫폼으로써의 가능성을 확인하였다.

□ 연구성과의 의미
▶ 무당쇄항체 생산용 마우스 제작 : 다양한 질병 바이오마커 발굴에 기여
○ 본 연구의 무당쇄항체 생산용 마우스 제작은 광범위한 바이오마커에 대한 무당쇄항체를 손쉽게 생산할 수 있는 시스템을 구축한 것이다. 이는 기존에 접근하기 어려웠던 당쇄구조 연구에 대한 새로운 방법을 제시한 것으로, 다양한 질병 바이오마커 발굴 및 당쇄체학 연구 발전에 기여할 것 이다.
▶ 종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법(ALIQUAT) 개발
  : 암 조기진단 촉진
○ 본 연구는 다양한 당쇄구조 바이오마커 분석을 위한 범용적인 정밀진단 플랫폼을 개발하여 체외진단 원천기술을 확보하였다. 이 플랫폼은 다양한 질병과 암의 조기진단을 촉진하고 효과적인 치료를 가능케 할 것이다.


연 구 결 과  문 답

이번 성과 뭐가 다른가

본 연구의 무당쇄항체 생산용 마우스 제작은 광범위한 바이오마커에 대한 무당쇄항체를 손쉽게 생산할 수 있는 시스템을 구축한 것임. 이는 기존에 접근하기 어려웠던 당쇄구조 연구에 대한 새로운 방법을 제시한 것으로, 다양한 질병 바이오마커 발굴 및 당쇄체학 연구 발전에 기여할 것.

연구를 시작한 계기는

비정상적인 당질화는 암과 같은 다양한 질병과 밀접한 관련이 있어 많은 당단백질 바이오마커가 연구에 사용되었음. 그러나 당쇄구조를 분석하기에 기존의 방법으로 당쇄를 제거한 항체는 연구에 사용하기에 여러 제약이 있었음.

에피소드가 있다면

간암진단 플랫폼을 개발하는 과정에서 필요한 표준물질을 일본 W사에서 구입하여 사용하던 중, 경쟁 제품을 만든다고 추정한 W사에서 판매를 중단함.
해당 표준물질을 생산하기 위한 추가 연구를 진행하였음.

어디에 쓸 수 있나

본 연구는 다양한 당쇄구조 바이오마커 분석을 위한 범용적인 정밀진단 플랫폼을 개발하여 체외진단 원천기술을 확보함. 이 플랫폼은 다양한 질병과 암의 조기진단을 촉진하고 효과적인 치료를 가능케 할 것임.

실용화를 위한 과제는

혈청과 같은 인체유래물은 다양한 생체분자를 포함하는 만큼 분석결과를 교란시키는 인자가 다양함.
이러한 교란인자의 영향을 제외시키기 위한 추가적인 연구들이 필요함.

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그림 1.  간암 바이오마커의 독특한 당쇄구조와 기존 면역분석법 플랫폼의 한계
 (위) 간암의 바이오마커인 AFP는 간암의 경우에만 퓨코오스(빨간 삼각형)가 추가된 독특한 당쇄구조를 갖는다.
(아래) 기본의 항체를 면역분석 플랫폼에 적용하는 경우, 항체의 당쇄구조가  진단 결과를 교란시킬 수 있다.

유전자가위기술을 이용한 무당쇄항체 생산용 마우스 제작 및 종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법(ALIQUAT) 개발

그림 2. 유전자가위기술을 이용한 무당쇄항체 생산용 마우스 제작 및 종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법(ALIQUAT) 개발

단일클론무당쇄항체의 검증

그림 3. 단일클론무당쇄항체의 검증
단일클론 무당쇄항체의 무당쇄 상태(왼쪽 위)와 체외진단적용을 위한 산화스트레스(오른쪽 위), 온도 및 시간(왼쪽 아래), pH (오른쪽 아래) 조건하에서의 안정성 검증

종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법 (ALIQUAT)의 정밀진단을 위한 분석능력 검증

그림 4.  종양 마커의 정량을 위한 무당쇄항체-렉틴 결합 면역분석법 (ALIQUAT)의 정밀진단을 위한 분석능력 검증

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