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[생명과학자 기초체력 다지기] #5_세포 배양
생명과학 이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터) (2020-12-10)

“생명 과학자 기초 체력 다지기” 다섯 번째 주제로는 “세포 배양”에 대해 알아보고자 한다. 그 중에서도 “무한 증식하는 암세포의 Passage number 기록이 왜 필요할까?”  “세포는 왜 confluent하게 키우면 안 되는 걸까?”  “암세포도 일정 passage 이상은 연속해서 사용하지 말라고 하는데, 동결 보존했던 세포는 왜 그런 얘기가 없는 걸까?” 세포 배양을 하는 연구자라면 한번쯤 가져 봤을 몇 가지 궁금증에 대해 알아 보고자 한다.

동물 세포 배양과 관련된 내용은 크게 동물 세포, 배양 배지, 배양 방법, 저장 방법으로 나눌 수 있다.


동물 세포

동물 세포는 동물의 조직 혹은 혈액으로부터 분리한 수명이 제한적인 primary 세포와 무한 증식이 가능한 (암)세포주로 나뉜다.

“Primary 세포”는 분화가 완료되어 증식하지 않거나, 일정 기간 동안만 증식이 가능한 세포로, 노화 과정을 거쳐 사멸하게 된다. 신체 조직 중 피부나 위 장관과 같이 쉽게 손상되고 복구되는 조직의 상피 세포나 혈관내피세포, 태아 세포나 줄기세포와 같이 분화가 덜 된 세포는 비교적 증식이 잘 되기 때문에 정상적인 세포의 기능 연구에 다양하게 사용된다.

“(암)세포주 (Cell line)”는 암 조직으로부터 직접 분리하여 단일 세포로부터 증식시켜 만들거나, primary 세포를 무한 증식이 가능하도록 불멸화(암세포화)시킨 세포를 말한다. 암세포주는 계대 배양하여 계속 사용이 가능하고, 동일한 특성이 유지되어 실험 결과의 재현성이 높기 때문에 암세포의 특성 연구나 특정 유전자를 도입한 후 기능 연구에 사용한다. 암세포주는 세포주은행으로부터 분양 받아 사용하는데, 계대 배양하면서 세포주의 계대 수 (passage number)를 기록한다.
 

 HeLa Cell Images

HeLa Cell Images [출처: Wikipedia]


첫번째 궁금증, 무한 증식이 가능한 암세포의 “Passage Number 기록”이 왜 필요할까?

그 이유를 설명하기에 앞서, 가장 흔히 사용되는 암세포주 중 하나인 “HeLa cell”의 기원에 대해 알아 보자. HeLa cell은 1951년 George Otto Gey가 Henrietta Lacks라는 자궁경부암 환자로부터 분리한 암세포로, 세포주명은 환자의 이름에서 유래하였다. 2020년 우리가 사용하는 HeLa 세포는 자그마치 70년 전 만들어져 세계 각국으로 퍼져 지금까지 계대 배양하면서 동일한 이름으로 사용되고 있다.

그럼 이 HeLa cell은 1951년 분리된 그 당시와 동일한 세포일까? 아마 이름을 제외하고 유전적으로 상당히 달라진 세포일 것이라고 쉽게 예상할 수 있다. 세포가 증식하려면 DNA 복제가 일어나야 한다. 세포가 비록 정교한 DNA 복제 시스템과 돌연변이 방지 시스템을 가지고 있다고는 하지만, 그 동안 증식을 거듭하면서 수많은 돌연변이가 축적되었을 것이다. 즉, 1951년도 HeLa cell과 지금 지구상의 어느 실험실에서 사용하는 HeLa cell은 유전적으로 절대 같지 않다는 사실이다.

2013년 Nature 논문에 따르면, 각기 다른 실험실에서 사용되는 HeLa cell을 비교 분석한 결과, 서로 구분되는 chromosome duplication, rearrangement가 확인되어 각 세포주가 서로 같지 않다는 사실이 확인되었다. DNA polymerase의 에러율은 10-8~10-10정도이고, human genome이 6.4x109 nucleotides로 이루어져 있으니, 대략 한번 복제할 때마다 1개 정도의 돌연변이가 발생할 수 있다는 계산이다. 돌연변이 1개가 통계적으로는 무의미한 수처럼 생각될 수 있지만, 겸상 적혈구 빈혈증 (Sickle cell anemia)이 단지 1개의 돌연변이 [GAG (Glu)->GTG (Val)]에서 비롯되었다는 사실을 생각하면 결코 무시할 수 없다.

실험 목적에 따라 다를 수 있지만, 적어도 각 실험실에서 행해지는 실험의 재현성을 확보하기 위해서는 그 실험실에서 사용하는 동안 세포주의 돌연변이 발생을 최소화하는 전략이 필요하다. 그 방법은 세포주은행으로부터 세포주를 분양 받은 후, 초기 배양 세포를 모세포로 master cell stock (GMP, master cell bank (MCB))을 만들고, master cell stock으로부터 증식시킨 세포를 working cell stock (GMP, working cell bank (WCB))으로 만들어 사용하는 것이다. 일정 passage 이상이 되면 새로운 master cell stock으로부터 증식시킨 세포나 다른 working cell stock을 사용한다. 이처럼 분양 후 passage number를 제한하여 돌연변이 축적을 최소화함으로써 실험의 재현성을 확보할 수 있다.

 

 세포 배양 기록지 예시

세포 배양 기록지 예시

 

다시 말해, 각 실험실에서 사용하는 세포주가 서로 동일하지는 않다고 하더라도, 분양 후 돌연변이로 인한 세포주의 특성 변화를 최소화하고, “실험의 재현성”을 확보하기 위해서는 세포주의 계대 배양 횟수를 모니터링하는 passage number 기록은 필요하다.


부유 세포 (suspension cell)와 부착 세포 (adherent cell)

동물 세포는 자라는 방식에 따라 “부유 세포”“부착 세포”로 나눌 수 있다.
“부유 세포”는 증식하기 위해 표면에 부착할 필요가 없는 세포이며, 혈액에 존재하는 대부분의 면역세포들이 여기에 속한다.

“부착 세포”는 증식하기 위해 표면에 부착이 필요한 세포이며, 상피세포 (epithelial cell)와 섬유아세포 (fibroblast)를 포함하여 대부분의 조직으로부터 유래된 세포가 부착 세포이다.

부착세포를 부착하지 못하도록 하면 세포는 증식하지 않고 사멸한다. 그러면 세포의 부착은 어떤 의미일까? 부착세포의 세포막에는 다양한 표면 단백질이 발현되는데, 그 중 세포의 부착에 관여하는 adhesion molecules은 in vivo에서는 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)이나 세포간의 결합에 관여한다.

이러한 결합은 세포의 신호 전달에도 중요한 역할을 한다. 세포 배양 용기 중 “cell culture treated”라고 명시된 것은 표면을 세포 배양에 적합하도록 만들었다는 의미이며, 주로 “positive charge”를 띠도록 처리한 것이다. 세포 표면은 일반적으로 negative charge를 띠기 때문에 세포의 부착이 촉진된다. 세포의 부착은 세포의 증식, 분화, 이동 등 다양한 활성에 관여하기 때문에 부착에 적합한 환경을 만들어 주는 것이 중요하다. 대표적인 ECM 성분인 collagen, fibronectin, laminin, gelatin을 배양 용기의 바닥에 coating해 주면 세포의 성장이 촉진된다. ECM 성분을 coating한 용기를 사용하면 부착력이 약한 세포도 떨어지는 것을 최소화할 수 있다.


배양 배지

배양 배지는 세포가 증식하는데 필요한 다양한 영양 성분, 성장 호르몬, vitamins, salts, 미량원소, 등을 포함한다. 배양 배지에는 화학적인 영양 성분 외에 다양한 성장 촉진 인자를 포함하는 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)을 첨가물로 사용한다. 단백질 생산이나 의약품 제조 목적의 세포 배양에는 FBS에 포함된 성분의 오염을 최소화하기 위해 화학적 대체 성분으로만 구성된 배양 배지를 사용하기도 한다. 세포주은행에서 각 세포주마다 최적화된 배지 정보를 제공하므로 그에 따르면 된다. 다만 실험 목적에 따라서는 배지를 최적화하는 과정은 필요하다.

재조합 단백질을 생산하는 경우, 각 세포주가 합성하는 전체 단백질 중 외래 단백질인 재조합 단백질이 차지하는 비중이 상당하며, 각 재조합 단백질을 구성하는 아미노산의 조성도 서로 다르다. 재조합 단백질을 구성하는 20종의 아미노산 중 1가지만 먼저 고갈되어도 해당 단백질은 만들 수 없기 때문에 재조합 단백질에 대한 세포주별 배지 최적화는 필요하다.
 

Culture media

Culture media (출처: Lonza)

 

두번째 궁금증, 배지에 첨가하는 FBS는 사용하기 전에 “heat inactivation”을 하는데 그 이유는 무엇일까?

FBS에는 세포 성장에 필요한 다양한 성분들과 함께 항체에 결합하여 cytotoxicity를 유발하는 면역 인자인 complement와 다양한 inhibitor들도 존재한다. Heat inactivation은 56°C에서 30분간 처리하는데, complement와 inhibitor들이 불활성화되어 잠재적인 cytotoxicity 유발 인자와 성장 저해 인자가 제거된다.

항체를 사용한 cytotoxicity assay나 teratocarcinomas, ES cell이나 insect cell lines 배양에는 heat inactivated FBS를 사용하여야 한다. 다만, 이러한 열처리에 의해 일부 성장 인자도 불활성화될 수 있기 때문에 필요성이 언급되지 않은 실험이나 보다 높은 온도로 장시간 열처리하는 것은 피해야 한다.


세포 배양 방법

동물 세포 배양은 각 세포주에 적합한 배지를 사용하고, 적정 수의 세포를 seeding하여 적정 시간 동안 배양하는 것이 중요하다.

부유 세포는 원심분리를 통해 비교적 손쉽게 회수하여 계대 배양할 수 있다. 반면, 부착 세포는 adherens junction (AJ)을 통해 배양 접시 표면에 부착되어 있으며, tight junction (TJ)을 통해 인접한 세포와 서로 결합하고 있다. 계대 배양 시 부착 세포를 떼어 내는 과정은 세포의 viability와 이어지는 실험 결과에도 영향을 미치므로 가장 신경 써야 하는 부분이다.


계대 배양 시 부착세포를 떼어내는 과정에 대해 좀 더 자세히 알아보자.

부착세포를 배양접시에서 떼어내기 위해서는 먼저 배지를 말끔히 제거하고, DPBS(Ca2+, Mg2+ free)로 씻은 후, Trypsin/EDTA를 처리하게 된다.

이때 DPBS 세척 단계도 세포를 떼어내는데 중요한 역할을 한다.

세포의 부착에는 부착 단백질 (AJ와 TJ)이 관여하며, 부착 단백질은 cofactor로 Ca2+ 이온을 필요로 한다. 배지에는 부착 단백질의 cofactor인 Ca2+ 이온이 다량 포함되어 있으며, FBS에는 anti-trypsin, alpha-2-macroglobulin이라는 Trypsin 저해제가 포함되어 있다. DPBS 세척 단계는 배지에 남아 있는 Ca2+이온과 Trypsin 저해제를 제거함으로써 Trypsin/EDTA 작용을 돕는다.

EDTA는 Ca2+과 같은 금속이온을 흡착하는 킬레이트 (Chelator)인데, 부착 단백질 (TJ)로부터 Ca2+ 이온을 흡착하여 제거함으로써 분자 구조를 변형시켜 세포를 떨어지게 한다.

Trypsin은 serine protease인데, 배양 접시에 부착되어 있는 세포 표면의 부착 단백질 서열 중 Arginine이나 Lysine의 C-말단 (--X-Arg(Lys)-/절단부위/-X--)을 인식하여 절단함으로써 세포를 배양접시로부터 떼어낸다.

Trypsin 처리 시간은 세포의 종류에 따라 최적화할 필요가 있다. DPBS, Trypsin/EDTA, 배지는 37°C 항온수조에서 데워서 사용하고, 처리 시간은 3분을 기준으로 최적화한다. 세포가 거의 둥글게 변하고 살짝 만 툭 치면 자연스럽게 떨어지는 정도가 좋다. Trypsin 처리 시간을 필요 이상으로 길게 하면 세포 표면단백질을 과도하게 손상시켜 세포의 생존율을 떨어뜨리고, 세포 표면 단백질 분석에 악영향을 미친다.

Trypsin을 처리한 후에는 FBS를 포함한 배지를 첨가하게 되는데, 그 이유는 FBS에 포함된 Trypsin 저해제가 Trypsin의 효소 작용을 정지시킨다.


세번째 궁금증, 세포주는 70~90% 정도 confluent하게만 배양하라고 하는데 그 이유는 뭘까?

세포가 confluent하게 자라면 “contact inhibition”과 cell growth arrest가 일어난다. 혈액을 통해 지속적으로 영양분을 공급하고 노폐물을 제거하는 생체와 달리 in vitro 배양 조건에서는 세포 주위에 노폐물, 주로 lactic acid가 국소적으로 축적된다. 배지의 산성화는 게놈의 안정성을 떨어뜨리고 DNA 손상으로 인한 돌연변이 발생을 증가시킨다. 또한 contact inhibition이 일어난 후에는 세포의 증식 속도와 전반적인 활성이 감소하여 후속 연구 결과에 영향을 미치므로 적정 밀도로 배양 하는 것이 중요하다.

또 다른 궁금증, 세포 배양 시 배지는 2~3일마다 한번씩 교환하는데, 세포 밀도가 낮으면 배지 교환을 5~10일 마다 해도 되나? 대답은 “No”.

배지 성분 중 FBS에 포함된 성장 인자의 반감기는 37℃의 배양 조건에서 길지 않다. 배지 교환 주기는 단순히 세포의 성장에 의한 배지 산성화뿐만 배지 성분의 활성과도 관계가 있다. 따라서, 이용 가능한 세포의 수가 적다면, 배양 용기의 크기를 줄여 세포의 밀도를 적정 수준으로 유지하고, 배지 교환 주기는 2~3일 간격으로 유지하는 것이 좋다.


세포 수

배양 혹은 세포를 사용한 실험에서 세포 수를 정확히 측정하여 일정한 세포수를 사용하는 것이 재현성 있는 결과를 얻기 위해 매우 중요하다. 예를 들어, 세포의 밀도가 너무 높으면 배지에 대해 서로 경쟁하고 노폐물이 쌓이는 속도도 증가하지만, 세포 수가 적당하면 세포끼리 분비하는 성장인자가 증식에 도움을 주지만, 세포 수가 너무 적으면 이러한 상승작용을 기대하기 힘들다. 약물에 대한 세포의 감수성은 적정 밀도에 비해 저밀도에서 증가하므로, cytotoxic한 약물의 활성을 평가할 때는 적정한 수준의 세포 밀도를 유지하는 것이 중요하다.


동물세포 배양에서 미생물 오염문제 해결

1. 오염이 해당 배양만의 문제인지 cell line의 문제인지에 파악하여 대응한다.
- 미생물 오염 발생 시 해결을 위한 첫 번째 원칙은 해당 배양액을 폐기하는 것이다.
- 새로운 stock이 있을 경우, 새로운 stock을 사용하여 배양한다.
  (새로운 stock이란 동일 Lot 혹은 다른 Lot일 수 있는데, 동일 Lot과 다른 Lot을 동시에 배양해서 동일 Lot만 문제가 있으면 문제의 Lot 전체를 폐기하고 다른 Lot을 사용한다)
- 새로운 stock에서 문제가 없으면 계속 사용하고, 새로운 stock에도 오염이 확인되면 세포의 종류에 따라 폐기 혹은 미생물 제거 단계를 진행한다.

2. Stable cell line과 같이 폐기가 어렵고, stock 전체가 오염된 경우는 항생제로 미생물 제거를 고려한다.
- 미생물 오염의 종류에 따른 특성을 파악한다.

1) Bacteria 오염
- 배양액에 항생제를 전혀 사용하지 않을 경우 발생할 수 있다.
- Penicillin/Streptomycin (P/S)를 사용하는 경우에도 이중 내성 미생물 오염 가능성은 있다.
- 현미경 상으로 지저분하게 보이고 배지 색깔 변화와 함께 탁하게 변할 수 있다.
- 이중 내성 미생물 오염이 의심되는 경우 Gentamicin과 같이 다른 기전의 미생물용 항생제를 추가해 볼 수 있다.

2) Mycoplasma 오염
- 증식 속도가 느려지고 세포 모양이 변할 수 있으며, 현미경 상으로 지저분하게 보인다.
- Mycoplasma는 증식 속도가 느리기 때문에 배지 색깔이 급격히 변하는 증상은 보이지 않는다.

3) Yeast/Fungi 오염
- P/S와 같은 세균용 항생제를 사용하였는데 배지 색깔이 급격하게 변하고 탁해지는 경우 Yeast 오염 가능성이 있다.
- 세균용 항생제인 P/S나 Gentamicin으로는 해결되지 않는다.
- 진균용 항생제인 Antimycotic (=Fungizone, Amphotericin B)를 사용해야 한다.

3. 배양액에 P/S을 사용하였고, 모든 stock이 오염되었고, 반드시 살려야 한다면,
- 새로운 stock을 꺼내 PBS로 씻고 원심분리를 일반적인 경우 (1,200 rpm)보다 낮은 rpm (500 rpm)으로 돌려 크기가 작은 미생물을 최대한 제거한다.
- 배양액에 P/S+Gentamicin+Antimycotic(=Fungizone, Amphotericin B)를 모두 첨가하여 배양한다.
- Passage를 거쳐 더 이상 미생물 오염 증상이 보이지 않을 때까지 항생제를 추가하여 배양한다.
- 미생물 제거 여부는 항생제를 제거한 상태로 배양하여 미생물 오염 증상이 더 이상 보이지 않으면 제거된 것으로 본다.

4. 이러한 노력에도 불구하고 문제가 해결되지 않으면, stable cell line이라 할지라도 폐기하고 세포주를 다시 만든다.


세포 저장 방법 

세포주를 사용하지 않을 때는 액체질소 (Liquid nitrogen)에 동결 보관한다.

세포주를 살아 있는 상태로 보관하기 위해서는 세포 저장용 동결 배지(Freezing medium)를 사용한다. 일반적으로 10~20% FBS가 포함된 배양 배지에 10% DMSO (Dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 사용하거나, 90% FBS에 10% DMSO를 첨가하여 사용한다. “DMSO는 cryoprotectant”라 불리는데, 세포 내에 크고 날카로운 얼음 결정이 생기는 것을 방지하여 세포 사멸을 억제한다. 대부분의 경우 DMSO를 사용 가능하나, HL60과 같이 DMSO에 의해 세포 분화 유도되는 경우에는 glycerol을 대체제로 사용한다.

세포 동결 속도도 중요한데, 세포 동결 vial을 freezing container에 담아 -70℃ 냉동고에 두면 분당 1℃ 정도의 일정한 속도로 온도가 떨어져 보다 안전하게 세포를 동결시킬 수 있다. 세포가 동결되면 신속히 액체질소 보관 용기에 옮겨 보관한다.
 

 Cryopreservation of cell line

Cryopreservation of cell line (출처: PDA)


“동물 세포의 동결 보존에 사용하는 DMSO는 어떻게 세포를 보호할까?”

DMSO는 극성 용매이지만 물과 잘 섞여 균질한 상태를 유지하고, 물의 freezing/melting 온도를 낮춘다. 순수한 물이 날카롭고 큰 얼음 결정을 만드는데 비해, 10% DMSO는 10배 정도 작고 무정형의 결정을 만든다. 이러한 이유로 날카로운 얼음 결정에 의한 세포의 손상을 방지한다.

DMSO는 극성 혹은 비극성 물질을 용해하는 성질을 가져 고농도의 실온에서는 세포막 성분을 녹여 구멍을 뚫어 세포를 파괴할 수 있다. 따라서, 세포를 얼릴 때는 DMSO를 포함한 저장용 배지를 사용하여 세포를 빠르게 현탁하고 동결시켜 실온에 노출되는 시간을 최소화해야 한다.

세포를 녹일 때는 37°C 항온수조에서 빠르게 녹여 얼음이 조금 남아 있는 상태에서 배지로 최소 10배 정도 희석해서 DMSO의 농도를 낮춰줘야 한다. 실온에서 DMSO의 농도가 0.5% 이상이 되면 세포막 손상을 일으킬 수 있다.  세포 동결 보존액의 DMSO 농도가 10%이고, 10배를 희석 해도 1%가 되므로, 희석용 배지는 차가운 상태로 사용하고, 4°C에서 원심분리 후 DMSO를 포함한 배지를 신속히 제거해야 세포 손상을 최소화할 수 있다.

또 한가지, 동결 보관한 세포를 계대 배양하여 사용할 때에는 일정 수준의 passage 이상으로는 사용하지 말라고 한다. 그 이유는 계대 배양 동안 세포의 변이 혹은 과밀 배양으로 인한 생리적인 활성 저하를 최소화하여 양질의 세포주를 사용하자는 취지로 생각된다.

그런데 동결 보관한 세포주에 대해서는 그러한 제한이 없다. 계대 배양을 계속하거나, 적정 confluent 이상으로 배양하여 상태가 나빠진 세포도 동결 보관했다가 다시 사용하면 상태가 정상으로 회복된 다는 것을 경험했을 것으로 생각된다.


마지막 질문으로, 계대 배양 횟수가 적정 수준 이상 된 세포주를 동결 보존했다가 다시 배양하면 상태가 양호해지는 이유는 뭘까?

세포를 장기간 배양하면 일부에서 돌연변이가 발생할 수 있지만, 국소적으로 밀도가 높은 세포는 contact inhibition에 의한 cell cycle arrest가 일어날 수 있다.  세포를 계대 배양 하는 과정에 성장 상태와 생리 활성이 달라진 다양한 상태의 세포를 사용하여 최상의 실험 결과를 얻기는 어렵다.

계대 배양 과정에 ~90% confluent 이상의 고밀도로 배양한 세포를 사용하면 transfection 효율이 상당히 저하된다는 것을 경험한 적이 있을 것이다. 하지만 그러한 세포도 동결 보관했다가 다시 배양해서 사용하면 회복된다는 것도 알고 있을 것이다.


“세포를 동결 보존하는 동안 어떤 일이 일어나는 것일까?”

세포주를 동결 보존하는 동안 세포 회복의 비밀은 DMSO가 가지고 있는 것으로 판단된다. 세포주를 동결 보존할 때 사용하는 DMSO는 1~2%의 저농도에서 가역적인 G1 phase cell cycle arrest를 유도하며, 세포의 생리 상태를 synchronize하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, contact inhibition을 회복시키고, 고밀도 배양으로 인한 세포 사멸을 방지하는 것으로 알려져 있다.

이러한 사실을 종합해 보면, 세포주를 사용한 실험에서 재현성 높은 실험 결과를 얻기 위해서는 세포주를 세포주은행으로부터 분양 후 초기 passage number의 세포로 다수의 master cell stock을 확보하고, 이 세포를 배양하여 만든 working cell stock을 사용하여 계대 배양 횟수를 최소로 유지하는 것이 필요하다는 것을 말해 준다.

 

[요약]

  • 무한 증식하는 암세포에 Passage number 기록은 필요할까? 세포주는 증식하는 동안 돌연변이가 발생할 수 있어 세포의 특성을 유지하고 결과의 재현성을 위해 passage number 모니터링은 필요하다.
  • 세포를 계대 배양할 ~90% confluent 하게만 배양 하라는 이유는 뭘까? Contact inhibition으로 인한 세포 생리활성의 변화를 최소화하기 위해 필요하다.
  • Primary 세포도 아닌 암세포주를 일정 passage까지만 계대 배양해서 사용하는 이유는 뭘까? 계대 배양 횟수가 증가할수록 돌연변이 가능성이 증가하고, 세포의 국소적인 밀도 차이로 인한 생리 및 활성 상태가 나빠지고 다양해져 최상의 결과를 얻기 어렵다.
  • 계대 배양 횟수가 적정 수준 이상 세포주도 동결 보존했다가 다시 배양하면 상태가 양호해지는 이유는 뭘까? 동결보존제로 사용하는 DMSO는 1~2%의 저농도에서 가역적인 cell cycle arrest를 통해 세포의 상태를 synchronize 시키고, 배양에 의한 contact inhibition으로부터 회복시키고 apoptosis를 방지하여 세포의 전반적인 생리 활성 상태를 리셋하여 회복시킨다.

 

참고문헌

Cell culture Wikipedia (https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_culture)

Yao T., Asayama Y. Animal-cell culture media: History, characteristics and current issues. Reproductive Medicine and Biology 2017; 16: 99-117.

Cryopreservation of cell lines (https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cryopreservation-of-cell-lines.html).

Fiore M., Zanier R., Degrassi F. Reversible G (1) arrest by dimethyl sulfoxide as a new method to synchronize Chinese hamster cells. Mutagenesis 2002;17(5):419-424.

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  댓글 3 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
회원작성글 포아이니  (2020-12-15 11:30)
1
항상 할때마다 궁금했던 것들인데 자세하게 알려줘서 속시원하네요

모르고 하는것과 알고하는것은 정말 큰 차이라고 생각합니다

꺼마워요~
회원작성글 지유아빠  (2021-06-03 17:31)
2
좋은 내용 연재해주셔서 큰 도움 되고 있습니다.

항상 감사드립니다.
회원작성글 이지아   (2021-11-29 17:42)
3
항상 궁금했던 내용인데, 자세하고 알기 쉽게 알려주셔서 유익하게 읽었습니다. 감사합니다!
 
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