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각종 혈관질환 줄기세포 치료제, 실시간 관찰 통해 효능 예측한다.
의학약학 한국과학기술연구원 (2020-11-23)

- 혈관으로 분화하는 줄기세포의 이식 초기 분포 영상을 통해 치료 효능 예측
- 혈관 재생을 위한 세포치료제 분야 연구에 응용

최근 식습관의 변화와 흡연, 음주로 인해 비만, 당뇨, 고혈압 등의 증가로 발끝이 썩어들어가는 중증하지혈과 같은  허혈성 질환의 고위험군 수가 증가하고 있다. 이러한 허혈성 질환을 치료하기 위해 새로운 혈관을 형성하는 줄기세포인 ‘혈관내피 전구세포’에 관한 연구가 활발하다. 혈관내피 전구세포는 허혈성 부위 등 혈관형성이 필요한 부위로 이동한 후 혈관의 내피세포로 분화하거나 혈관의 형성을 돕는 인자를 방출하여 혈관재생을 유도하기 때문에 허혈성 질환을 비롯한 혈관과 관련된 질환의 세포치료제로 개발할 수 있다.

그러나 혈관 재생능력이 뛰어난 혈관내피 전구세포를 혈관재생을 위한 세포치료제로 사용하더라도 치료 결과는 체내 이식된 세포의 생존, 치료 부위로의 이동과 같은 다양한 변수에 의해 다르게 나타나며 정확한 치료 효능의 관찰 및 예측이 어렵다는 한계점이 있어 허혈성 질환의 치료제는 아직 상용화되지 못하고 임상단계에 머물러 있는 상황이다.

한국과학기술연구원(KIST, 원장 윤석진)은 테라그노시스연구센터 김광명 박사팀이 ㈜T&R Biofab 문성환 박사팀과의 공동연구를 통해 혈관내피 전구세포의 체내 이식 후 초기 분포 및 이동을 형광 영상으로 추적하여 초기 이식된 혈관내피 전구세포의 분포에 따른 치료 효능을 예측할 수 있는 기술을 개발했다고 밝혔다.
 

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<한국과학기술연구원 김광명 박사, 윤홍열 박사>


KIST 김광명 박사팀은 형광물질을 혈관내피 전구세포 표면에 결합시킨 후 형광분자단층촬영을 통해 식별 가능하게 했다. 그 후 중증하지허혈질환 쥐의 허벅다리에 이식된 세포를 28일 동안 영상을 통해 추적하여 세포의 체내 움직임을 확인하고, 레이저 측정을 통해 혈류가 복원되는 과정을 추적, 관찰하였다. 그 결과 혈관내피 전구세포가 허혈성 질환이 발생한 조직으로 이동하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 세포치료제 이식 초기에 혈관내피 전구세포를 촬영한 영상을 분석한 결과, 두 가지 형태로 주입된 것을 확인할 수 있었다. 하나는 응축되어 있는 ‘둥근 모양’, 다른 하나는 널리 퍼진 ‘확장된 모양’이었다. 이 두 가지 형태로 실험군을 분류하여 치료 효능을 관찰한 결과 처음 이식된 곳에 잘 응축되어 있던 ‘둥근 모양’의 실험군에서 세포가 더 잘 이동하고 치료 효능이 좋았음을 확인했다. 이를 통해 치료 초기에 치료제가 응축된 ‘둥근 모양’으로 형성되어야 앞으로의 치료 효능이 좋으리라는 것을 예측할 수 있었다.

본 연구를 주도한 KIST 김광명 박사는 “초기에 이식된 세포치료제의 형태 및 체내 초기 변화를 빠르고 정확하게 모니터링하는 기술은 이식된 혈관내피 전구세포의 허혈성 질환 치료효능을 초기에 예측할 수 있도록 하여 향후 허혈성 질환 치료를 위한 세포치료제 개발 분야에 활용될 것”으로 기대하고 있다.

본 연구는 과학기술정보통신부(장관 최기영) 지원으로 KIST 주요사업과 한국연구재단 중견연구자지원사업 등으로 수행되었으며, 이번 연구결과는 생체재료 분야 국제 저널인 ‘Biomaterials’ (IF: 10.317, JCR 분야 상위 1.316%) 최신 호에 게재되었다.
 * (논문명) Predicting in vivo therapeutic efficacy of bioorthogonally labeled endothelial progenitor cells in hind limb ischemia models via non-invasive fluorescence molecular tomography

   - (제 1저자) 한국과학기술연구원 임승호 박사과정
   - (제 1저자) 한국과학기술연구원 윤홍열 선임연구원
   - (교신저자) T&R Biofab 문성환 박사
   - (교신저자) 한국과학기술연구원 김광명 책임연구원
 

연구결과 개요

1. 연구배경
혈관내피 전구세포는 태아의 혈관 신생 과정에서 주로 관여하는 세포지만 허혈성 질환 부위에서 발생하는 사이토카인, 성장인자 또는 호르몬 등의 외부 환경에 반응하여 혈관형성이 이루어질 곳으로 이동하여 혈관 내피세포로 분화하거나 혈관형성 촉진 인자를 방출하여 혈관형성을 유도하는 특성을 갖기 때문에 허혈성 질환이나 망막병증 등 여러 질환에서 혈관형성을 위한 세포치료제로 연구되고 있다. 그러나 혈관 재생능력이 뛰어난 혈관내피 전구세포를 혈관재생을 위한 세포치료제로 사용하더라도 치료 결과는 체내 이식된 세포의 생존, 치료 부위로의 이동과 같은 다양한 특성에 의해 다르게 나타나며 결국 치료 효능을 낮추는 원인이 될 수 있다. 따라서 혈관내피 전구세포를 이식 후 체내 거동을 정확히 파악하고 치료 효능을 예측할 수 있는 모니터링 기술이 필수적이다.

2. 연구내용
중증하지허혈은 다리의 혈액을 공급해주는 혈관이 막혀 혈류가 감소하는 질환인 말초동맥질환의 심각한 단계를 말하며, 이를 치료하기 위해 중간엽 줄기세포 및 혈관내피 전구세포등 다양한 세포치료제 연구가 진행되고 있다.
본 연구팀은 인간배아줄기세포(Embryonic stem cell)에서 분화시킨 혈관내피 전구세포(Endothelial progenitor cell)를 생물직교성 클릭화학 기반 표지기술 (Bioorthogonal click chemistry)을 이용하여 근적외선 형광체를 세포 표면에 결합한 후 중증하지허혈 질환 동물모델의 허벅다리에 이식하여 4주(28일) 동안 세포의 거동을 근적외선 형광 분자 단층 촬영(fluorescence molecular tomography, FMT)을 이용해 분석하였다.
생물직교성 클릭화학 기반 표지기술(Bioorthogonal click chemistry)은 기존의 세포표지 기술의 한계인 낮은 표지 효율, 세포독성을 극복하고 세포치료제의 기능에 영향을 주지 않는 새로운 표지 방식이다. 이를 이용하여 본 연구팀은 아지드(N3)기가 함유된 만노자민 유도체를 혈관내피 전구세포(Endothelial progenitor cell)에 처리하여 세포표면에 아지드기를 도입하고 DBCO-Cy5 형광체를 생물직교성 클릭화학을 통해 표지하여 형광체로 표지된 혈관내피 전구세포를 확보하였다 (그림 1 상).
형광체로 표지된 혈관내피 전구세포를 중증하지허혈 쥐 모델의 허벅다리에 이식한 후 28일 동안 FMT 영상을 통해 체내 거동을 확인하였으며 (그림 1 하) 레이저 도플러 영상 측정을 통해 혈류가 복원되는 과정을 모니터링하였다. 본 연구팀은 처음 이식된 세포의 FMT 영상을 바탕으로 '응축된 둥근 모양'과 '확장된 모양' 두 가지로 동물을 분류하여 치료 효능을 관찰했을 때 '응축된 둥근 모양'의 세포는 '확장된 모양'의 세포와 비교하여 더 높은 하지허혈 치료 효능을 나타내는 것을 확인함으로써 이식된 혈관내피 전구세포가 혈관이 폐색된 부분으로 이동하는 것뿐만 아니라 초기 이식된 세포의 형태가 중증하지허혈 치료 효능과 상관관계가 있는 것을 발견하였다.

3. 기대효과
본 연구는 초기에 이식된 세포치료제의 형태 및 체내 초기 변화가 치료 효능에 영향을 줄 수 있다는 것을 입증한 중요한 연구 결과이며, 본 연구팀은 허혈성 질환 세포치료제의 치료 효능을 초기에 예측하고 이를 향상시키는데 큰 단서를 제공할 수 있을 것으로 기대하고 있다.


연구결과 문답

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

◯ 세포치료제를 이용한 재생의학에서 세포치료제의 체내 분포 및 이동 그리고 치료효능과 연관된 생체내 세포의 변화를 추적하는 것은 치료 효과를 이끌어 내는데 중요한 요소입니다. 최근 다양한 줄기세포를 이용한 세포치료제들의 개발이 활발이 이루어지고 있고 이들의 괄목할 만한 치료 효능은 생체외 환경에서 상당히 높은 수준으로 검증되고 있습니다. 그러나 체내 이식된 세포치료제는 생체외 환경에서 평가된 것과 달리 다양한 치료효능을 보이기 때문에 이식된 세포치료제를 추적하고 치료효능을 예측할 수 있는 기술의 개발이 필수적입니다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

◯ 기존의 허혈성 질환의 치료를 확인하는 방법으로는 혈관조영술, 레이저도플러 영상을 이용해 혈류를 측정하거나 조직 검체를 이용해 조직학적 분석이 이용되고 있습니다. 기존의 치료 효능 평가 방법은 세포치료제 이식 후 장기간 모니터링이 이루어져야 하고 치료 효능을 예측하기 어렵다는 단점이 있습니다.
◯ 본 연구는 이식된 혈관내피 전구세포의 초기 이식 형태 및 초기 이동을 형광단층촬영을 통해 비침습적으로 관찰하고 치료 효능과의 연관성을 밝힘으로써 성공적인 허혈성 질환의 치료를 위해서는 초기 세포치료제의 이식형태가 중요함을 확인하였습니다.
◯ 이러한 혈관내피 전구세포의 추적영상은 당대사공학과 클릭화학을 이용하여 독성이 없고 세포 기능에 영향을 미치지 않으며 고감도 형광단층영상이 가능하도록 혈관내피 전구세포를 표지하여 관찰할 수 있었습니다.

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나?

◯ 본 기술은 초기 이식된 세포치료제의 이식된 형태와 초기 이동 특성을 관찰하여 치료 반응성을 예측하고 이를 통해 치료 전략을 수립할 수 있도록 함으로써 다양한 세포치료제 개발 및 치료 효능 향상에 활용할 수 있을 것으로 기대합니다.

생물직교성 클릭화학을 이용한 혈관내피 전구세포의 형광 표지 및 하지허혈 쥐 모델에 이식 후 모니터링 모식도

[그림 1]
생물직교성 클릭화학을 이용한 혈관내피 전구세포의 형광 표지 및 하지허혈 쥐 모델에 이식 후 모니터링 모식도

FMT로 관찰한 이식된 혈관내피 전구세포의 시간에 따른 체내 이동 이미지

[그림 2] FMT로 관찰한 이식된 혈관내피 전구세포의 시간에 따른 체내 이동 이미지.
세포 이식 직후의 형광의 분포가 응축된 모양일 경우 형광으로 표지된 혈관내피 전구세포는 시간에 따라 배쪽 (혈관 폐색 부위)으로 이동하는 것을 볼 수 있음. 그러나 확장된 모양으로 이식된 혈관내피 전구세포는 배쪽으로의 이동 뿐만아니라 주변으로 확산되는 경향을 보이며, 28일째 형광이 관찰되지 않음.

혈관내피 전구세포 이식후 하지허혈 쥐 모델의 혈류 재생 및 사지괴사 모니터링

[그림 3]
혈관내피 전구세포 이식후 하지허혈 쥐 모델의 혈류 재생 및 사지괴사 모니터링. 세포 주입 직후 응축된 모양으로 혈관내피 전구세포가 이식된 쥐에서 더 높은 혈류 재생 유도 및 사지 괴사 방지가 일어나는 것을 확인함.

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