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[실험을 해봅시다] (6) 세포 키우기-4: 포유류 세포를 키웁시다-2
생명과학 Esprit (2020-11-13)

지난 시간에 우리는 포유류 세포를 키우는 원리에 대해 알아보았습니다. 포유류 세포를 키우는 원리를 알아봤으면 구체적으로 어떻게 키우는지 알아보는 것이 필요합니다. 이번 시간에는 포유류 세포를 키우는 구체적인 방법에 대해 알아보겠습니다.

포유류 세포를 처음 배양할 때는 어떻게 할까요? 조직을 직접 채취하지 않는 이상 대부분 American Type Culture Collection(ATCC)나 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 등에서 동결된 세포주를 분양받거나, 다른 실험실에서 동결된 세포주(~1 mL)를 분양받는 걸로 시작합니다. 통상 세포주를 분양하는 기관에서는 세포주의 특성(유래, 부착성, 모양 등)과 배양 방법(배지, 계대 배양(subculture), 배양 조건, 동결 방법 등)에 대한 정보를 제공하며, 다른 실험실에서 분양받을 때도 세포주를 분양받기 앞서 이러한 정보를 제공받아야 세포주를 배양할 준비를 할 수 있습니다. 동결 세포주를 받은 경우 다음과 같이 세포를 배양합니다(그림 1)1). 동결 세포주를 녹이기 전에 세포 배양실에 배지와 배양 용기, 청정실험대, 배양기(37oC 유지 및 CO2 공급), 수조(water bath: 37oC로 유지), 원심분리기(centrifuge), 원심분리용 튜브(centrifuge tubes, 멸균된 상태로 시판)주1), 일회용 피펫(disposable pipette, 멸균된 상태로 시판), 피펫 에이드(pipette aid)를 미리 준비합니다. 실험자는 세포 배양실에 있으면서 실험복을 입고 실험용 장갑을 착용하고 있어야 합니다.

배지가 담긴 유리병을 수조에 넣어 37oC로 온도 평형이 되도록 준비하고, 동결된 세포주를 빠르게 녹인 다음주2), 세포주가 들어있는 바이알(vial) 표면을 70% 에탄올로 소독한 뒤 청정실험대 안에서 바이알 뚜껑을 돌려 엽니다. 그 다음 청정실험대 안에서 바이알 안에 들어 있는 세포주를 원심분리용 튜브에 옮겨 담고, 세포주가 담긴 원심분리용 튜브에 미리 데워 둔 배지 9 mL을 추가합니다. 그 다음 원심분리(통상 125 x g, 10분이나 조절 가능함)를 하고 상층액을 제거한 뒤, 남은 세포를 새로운 배지 1-2 mL로 현탁합니다. 세포 현탁액을 충분한 양의 배지가 담긴 배양 용기로 옮기고 배양 용기를 적당히 흔들어 줍니다. 이때 반드시 배양 용기에 배지가 담긴 상태에서 세포 현탁액을 투입해야 세포가 전체적으로 고르게 자랄 수 있습니다. 그 다음 배양 용기를 배양기에 넣고, 하루가 지난 뒤 세포 상태를 현미경으로 관찰하고 필요한 경우 계대 배양을 합니다.

 

동결 세포주를 배양하는 방법. 세포주의 정보를 파악하고 세포 배양실 내 준비를 한 뒤 동결 세포주를 녹여서 배양합니다

그림 1. 동결 세포주를 배양하는 방법. 세포주의 정보를 파악하고 세포 배양실 내 준비를 한 뒤 동결 세포주를 녹여서 배양합니다.


계대 배양이란, 원래 배양에서 일부 세포를 새로운 배지로 옮겨서 새롭게 배양하는 것을 의미합니다. 앞선 시간에 세포 밀도가 너무 높으면 세포가 배출하는 노폐물이 많이 쌓여서 세포에 악영향을 줄 수 있다고 언급한 바 있습니다. 반면 세포 밀도가 너무 낮으면 원하는 만큼 배양하는데 시간이 오래 걸립니다. 따라서 계대 배양을 통해서 세포 밀도를 적절하게 조절하여 세포 배양을 원활하게 할 수 있습니다(그림 2). 통상적인 계대 배양 주기는 세포주를 분양하는 기관에서 제공하며, 2-3일마다 하는 경우가 많지만, 반드시 세포의 상태를 현미경으로 관찰하여 판단해야 합니다.
부착형 세포의 경우, 배양 접시의 70-90% 정도를 채우는 시점에서 계대 배양합니다. 부착형 세포는 배양 접시 바닥에 부착되어 있기 때문에 새로운 배양 접시로 옮기기 위해서는 세포 표면에 존재하는 세포 접합 분자(cell adhesion molecules)와 배양 접시 바닥 표면에 존재하는 세포외 기질(extracellular matrix) 사이의 결합을 떼어내야 하고, 이때 필요한 것이 trypsin-EDTA 용액입니다. Trypsin-EDTA 용액 외에도 부착형 세포를 계대 배양할 때는 세포가 자라고 있는 기존의 배양 접시, 새로운 배지, 멸균한 PBS가 필요하며, trypsin-EDTA 용액, 새로운 배지(FBS 등 혈청 포함), 멸균한 PBS는 37oC로 미리 데워 둬야 합니다.

우선 청정실험대 안에서 기존의 배양 접시에 있는 배지를 흡입(suction)하는 방법으로 제거한 다음, 멸균한 PBS로 세포를 씻어주고 흡입하여 제거합니다. 그 다음 trypsin-EDTA 용액을 2-3 mL 넣고 배양 접시 전체적으로 퍼지게 합니다. 그 다음 배양 접시 뚜껑을 닫고 배양 접시를 배양기에 넣고 5분 정도 둡니다주3). 그러고 나면 대부분의 부착형 세포들은 배양 접시 바닥에서 떨어져서 동그란 모양으로 보이고, 이러한 현상은 현미경으로도 관찰할 수 있습니다. 그 다음 trypsin의 작용을 억제하기 위해, 청정실험대에서 배양 접시에 새로운 배지를 6-8 mL 추가하고, 배양 접시를 기울이고 일회용 피펫을 이용해 세포 현탁액으로 배양 접시 바닥을 씻어주는 방법으로 배양 접시 바닥에 남은 세포들을 배양 접시 한 켠에 모읍니다. 그리고 세포 현탁액을 원심분리용 튜브에 넣고 원심분리한 다음, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 남은 세포를 새로운 배지 2-4 mL로 현탁해둡니다. 새로운 배양 접시에 새로운 배지를 적당량 넣어 두고, 현탁해둔 세포를 통상적인 계대 배양 비율에 따라, 또는 현탁액 안에 있는 살아 있는 세포의 수를 세어 해당 배양 접시에 적합한 수의 세포를 넣습니다.

이때 중요한 것은 새로운 배양 접시에 새로운 배지를 미리 넣어둬야 하는 건데, 빈 배양 접시에 세포 현탁액을 넣는 경우 세포가 한쪽에만 깔려서 제대로 된 배양이 어려울 수 있습니다. 통상적인 계대 배양 비율은 세포주를 분양하는 기관에서 제공하며, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10 등 다양한 비율이 가능합니다. 예를 들어 세포 현탁액이 4 mL 있고, 계대 배양을 1:10으로 한다면 새로운 배지가 담긴 새로운 배양 접시에 세포 현탁액을 0.4 mL 추가하면 됩니다. 세포 현탁액을 넣은 다음에는 배양 접시를 잘 흔들어주고, 배양 접시를 배양기에 넣습니다. 세포에 따라서는 trypsin-EDTA 용액으로 떼어내는 것보다 cell scraper를 이용하여 떼어내거나, trypsin-EDTA 용액을 넣고 cell scraper를 이용하여 떼어내는 경우도 있습니다.

부유형 세포의 경우, 세포 밀도가 중요합니다. 처음에 세포주를 녹일 때 세포주에 따라 2.0x104 - 5.0x105 cells/mL의 밀도로 시작하며, 세포주에 따라 다르지만 최대 2.0x106 cells/mL까지 유지할 수 있습니다. 부유형 세포는 배양 플라스크에 부착되어 있지 않기 때문에, 부착형 세포와 달리 배양 용기에서 떼어낼 필요가 없습니다. 부유형 세포를 계대 배양할 때는 세포가 자라고 있는 기존의 배양 플라스크, 새로운 배지가 필요하며, 새로운 배지는 37oC로 미리 데워 둬야 합니다. 우선 청정실험대 안에서 기존의 배양 플라스크에 있는 세포 현탁액을 일회용 피펫을 이용해 완전히 혼합하고, 세포 현탁액 일부를 취해 살아 있는 세포의 수를 셉니다. 그리고 기존의 배양 플라스크에 있는 배지의 양을 고려하여 해당 세포주가 필요로 하는 최소 세포 밀도가 되도록 새로운 배지를 기존의 배양 플라스크에 추가합니다.

예를 들어 살아 있는 세포가 총 5.0x106개 있고, 기존 배지의 양이 10 mL이며, 최소 세포 밀도가 2.0x105 cells/mL인 경우, 배지의 양이 총 25 mL이면 최소 세포 밀도가 됩니다. 기존 배지의 양이 10 mL이므로 새로운 배지 15 mL을 추가하면 됩니다. 한편 세포 밀도가 너무 높거나 배지가 노란 빛을 띌 경우, 세포 배양액 전부를 원심분리한 다음 상층액을 흡입하여 제거합니다. 남은 세포를 새로운 배지 2-4 mL로 현탁해두고, 현탁액 안에 있는 살아 있는 세포의 수를 셉니다. 그리고 배양할 세포의 수를 고려해 그만큼의 세포를 최소 세포 밀도로 배양하기 위해 필요한 배지의 양을 계산하고, 새로운 배지를 새로운 배양 플라스크에 넣어둡니다. 그 다음 필요한 양만큼의 세포를 새로운 배지를 넣어둔 배양 플라스크에 넣습니다.
 

계대 배양하는 방법

그림 2. 계대 배양하는 방법. 부착형 세포는 배양 접시에서 70-90% confluency를 보일 때, 부유형 세포는 수시로 세포 밀도를 체크하여 최대 세포 밀도에 도달하기 전에 계대 배양해야 합니다. 부착형 세포는 배양 접시에서 세포를 떼어 내어 새로운 배지가 있는 배양 접시에 세포 일부를 추가하는 방법으로, 부유형 세포는 최소 세포 밀도가 되도록 배양 플라스크에 배지를 추가하는 방법을 기본으로 합니다.


살아 있는 세포의 수를 세고 생존율을 계산할 때는 혈구계산기(hematocytometer), 커버 슬립(cover slip), Trypan Blue 시약, 96 well plate, 현미경, 계수기(counter)가 필요합니다. Trypan Blue 시약을 사용하는 이유는, 살아 있는 세포는 세포막이 온전하여 Trypan Blue 시약이 세포 내로 들어올 수 없어서 염색되지 않고, 죽은 세포는 세포막이 깨져서 Trypan Blue 시약이 세포 내로 들어와 염색되기 때문입니다. 살아 있는 세포의 수를 셀 때는 다음과 같은 방법으로 합니다(그림 3). 세포의 수를 세기 앞서 혈구계산기와 커버 슬립을 깨끗이 닦아서 습기가 없도록 하고, 혈구계산기 위에 커버 슬립을 올려둡니다. 그 다음 청정실험대 안에서 96 well plate의 well 중 하나에 적당량의 Trypan Blue 시약을 넣고, 숫자를 세고자 하는 세포가 들어있는 현탁액 일부를 Trypan Blue 시약이 들어 있는 well에 넣고 피펫팅하여 섞어줍니다. 잘 섞어준 혼합액 중 10 μL를 취해 혈구계산기와 커버 슬립 사이 오목한 공간에 넣어줍니다. 그 다음 혈구계산기를 현미경으로 관찰하면(통상 100배 배율 권장), 총 4군데의 귀퉁이가 있습니다. 각 귀퉁이에 초점을 맞춰 현미경으로 관찰하면서 살아 있는 세포의 숫자를 세고, 이를 토대로 세포 현탁액에 있는 살아 있는 세포의 숫자를 셀 수 있습니다. 각 귀퉁이는 가로 0.1 cm, 세로 0.1 cm, 높이 0.01 cm이므로, 각 귀퉁이의 부피는 0.1 cm x 0.1 cm x 0.01 cm = 10-4 cm3가 되고, 이는 10-4 mL에 대응됩니다. 세포 현탁액과 Trypan Blue 시약을 혼합할 때는 각 귀퉁이당 10-100개의 살아 있는 세포가 보이도록 비율을 조절합니다.

예를 들어 세포 현탁액이 4 mL 있고, Trypan Blue 시약 75 μL와 세포 현탁액 25 μL를 혼합하여 이 중 10 μL를 혈구계산기에 넣었다고 가정합시다. 그리고 4군데의 귀퉁이에서 각각 56, 60, 54, 70개의 살아 있는 세포를 세고, 1, 0, 2, 1개의 죽은 세포를 셌다고 해봅시다. 이 경우 살아 있는 세포의 밀도는 (56+60+54+70) cells x 4(희석 농도 고려)/ (4 x 10-4 mL) = 2.4 x 106 cells/mL이 되고, 세포 현탁액의 부피가 4 mL이므로 세포 현탁액 전체에는 9.6 x 106개의 살아 있는 세포가 존재합니다. 그리고 죽은 세포의 숫자도 셌기 때문에 세포 생존율도 계산할 수 있습니다. 이 예시에서는 4군데의 귀퉁이로부터 살아 있는 세포는 총 240개를 셌고, 죽은 세포는 총 4개를 셌습니다. 따라서 세포 생존율은 240/(240+4) x 100 = 98.36%입니다.

 

세포의 수를 세고 생존율을 계산하는 방법

그림 3. 세포의 수를 세고 생존율을 계산하는 방법. 혈구계산기를 커버 슬립으로 덮고, 혈구계산기와 커버 슬립 사이 오목한 공간에 Trypan Blue와 세포 현탁액 혼합액을 넣습니다. 그 다음 현미경으로 관찰하면서 각 귀퉁이에 초점을 맞추면서 생존 세포와 죽은 세포의 수를 세면 세포 현탁액 내 생존 세포 수와 세포 생존율을 계산할 수 있습니다.


다음으로, 동결된 세포주를 만드는 방법입니다. 앞서 세포주를 분양 받을 때 동결된 형태로 받는다고 했는데, 매번 필요할 때마다 분양 받을 수는 없으니 만드는 방법을 알고 있어야 합니다. 그리고 바로 사용할 세포가 아니면 계속 계대 배양하는 것보다 동결된 세포주로 만들어 두는 것이 시간과 배지를 아끼고, 같은 passage를 유지할 수 있어 일정한 실험 결과를 낼 수 있게 됩니다. 동결된 세포주를 만들 때는 동결 보존용 바이알(cryopreservation vial), FBS, 동결 보호제(cryo-protectant – 주로 cell culture grade dimethyl sulfoxide(DMSO) 사용), 동결 속도 조절 챔버(controlled rate freezing chamber), 냉동고(-80oC), 액체질소 냉동고(<-130oC)가 필요합니다. 동결 보호제는 세포 내부에 얼음 결정이 생기는 것을 막아주고, 동결 속도 조절 챔버는 세포를 천천히 동결시켜(1분에 1oC씩) 세포 내부의 물이 세포에서 빠져나올 수 있게 도와줍니다. 청정 실험대 안에서 세포를 배양 용기에서 떼어내거나 꺼내서 멸균된 원심분리 튜브에 넣고 원심분리한 다음, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그 다음 남은 세포를 새로운 배지 2-4 mL로 현탁해두고, 살아 있는 세포의 수를 센 다음 다시 원심분리합니다. 원심분리할 동안 청정 실험대 안에 동결 보존용 바이알, FBS, 동결 보호제를 준비합니다.

통상 5x106 cells/mL이 될 수 있도록 동결 보존액을 만드는데, FBS와 DMSO를 9:1로 혼합하여 만듭니다. 예를 들어 5x107개의 세포가 있으면 FBS 9 mL과 DMSO 1 mL을 혼합하여 동결 보존액을 준비합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 흡입하여 제거하고, 미리 만들어둔 동결 보존액으로 남은 세포를 현탁한 다음, 동결 보존용 바이알에 1 mL씩 분주합니다. 그 다음 동결 보존용 바이알을 동결 속도 조절 챔버주4)에 넣은 다음 냉동고(-80oC)에 넣어 얼립니다. 동결된 세포주가 만들어진 뒤에는 액체질소 냉동고(<-130oC)에 넣어 보관합니다. 동결된 세포주는 몇 년간 사용할 수 있는데, 얼리고 녹이는 과정(freeze-thaw cycles)이 반복될수록 수명이 줄어듭니다. 그렇기 때문에 동결된 세포주를 처음 만들 때 여러 개를 만들어두고(마스터 세포 은행(master cell bank), 마스터 세포 은행에 있는 동결된 세포주 중 하나를 바탕으로 세포를 배양하여 여러 개의 동결된 세포주를 만들어 두는 게 좋습니다. 이러한 과정을 반복하면 많은 수의 동결된 세포주를 확보하고, 실제 실험에 활용할 세포주를 확보할 수 있습니다(작업용 세포 은행(working cell bank)). 동결된 세포주를 액체질소 냉동고에 보관할 때는 주기적으로 액체질소를 채워주도록 하고, 액체질소 냉동고에 세포주를 넣고 뺄 때 동상을 입지 않도록 반드시 운동화와 동상 방지 장갑, 고글을 끼고 다룰 수 있도록 합니다.

 

동결된 세포주 만드는 방법

그림 4. 동결된 세포주 만드는 방법. 배양 용기에서 세포를 취해 살아 있는 세포의 수를 세고, 원심분리한 뒤 동결 보존액으로 현탁하여 동결 보존용 바이알에 분주합니다. 바이알을 동결 속도 조절 챔버에 넣고 냉동고에 넣어 동결된 세포주를 만들고, 액체질소 냉동고에 넣어 보관합니다.


마지막으로 포유류 세포를 배양할 때 중요한 것이 오염 관리입니다. 포유류 세포는 다양한 오염에 노출될 수 있고, 오염되는 경우 포유류 세포의 생장이 저해되고 영향을 받아 실험에 지장을 줍니다. 오염의 종류와 상관없이 세포 배양실을 따로 두고, 청결하게 관리하며(주기적인 청소 및 사용하지 않을 때 UV등을 켜둠), 배지를 필터하여 사용하는 것은 기본입니다. 세균, 진균이나 효모(yeasts), 마이코플라즈마(Mycoplasma) 등이 포유류 세포를 배양할 때 오염을 일으킬 수 있습니다. 우선 세균에 오염되는 경우 배지가 뿌옇게 되고, 세균 대사의 산물로 인해 배지가 갑자기 노랗게 변합니다. 세균으로 인한 오염은 주로 물을 통해서 발생하는데, 이를 막기 위해 수조와 배양기를 주기적으로(한 달에 한 번은 꼭 하는게 좋습니다.) 세척하고, 수조와 배양기에 멸균한 물을 보충해야 합니다주5). 그리고 배지에 반드시 항생제를 넣어서 만들어야 합니다. 진균이나 효모에 오염되는 경우 섬유질 물질(진균)이나 세포와 구분되는 동글동글한 모양(효모)이 현미경으로 관찰됩니다. 진균이나 효모로 인한 오염은 주로 공기를 통해 일어나는데, 이를 막기 위해 계절이 바뀔 때마다 공조 시스템(air conditioning system)을 청소하는 것이 필요합니다.

마이코플라즈마는 세균의 일종이지만 굳이 따로 언급한 이유는 다른 세균과 달리 세포벽이 없고, 따라서 세포벽 형성을 표적으로 하는 항생제에 대한 내성이 있기 때문입니다. 마이코플라즈마에 오염되는 경우 육안으로 확인하기 어렵지만 염색체 변화를 유발하여 포유류 세포 생장에 악영향을 줍니다. 마이코플라즈마 오염을 막기 위해서는 세포를 구입하거나 다른 실험실에서 받아온 세포주를 배양할 때 별도의 배양기에서 배양한 다음 일부를 취해 오염 여부를 테스트하는 것이 필요합니다. 마이코플라즈마 특이적 염기서열을 인식하는 프라이머를 이용하여 특이적 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하면 해당 세포주가 마이코플라즈마에 오염되었는지 쉽게 확인할 수 있습니다. 마이코플라즈마에 오염된 세포는 실험에 사용하지 않고, 오염되지 않은 세포만 사용해야 다른 세포들도 오염되는 상황을 막을 수 있습니다. 마이코플라즈마 오염 테스트는 주기적으로 하는 게 좋습니다.
 

포유류 세포 배양에 있어서의 오염의 종류와 관리

그림 5. 포유류 세포 배양에 있어서의 오염의 종류와 관리. 세균, 진균 및 효모, 마이코플라즈마 등으로 인한 오염이 가능하며, 오염의 종류에 따라 징후를 체크하고 예방할 수 있도록 해야 합니다.


이번 시간에는 포유류 세포를 키우는 구체적인 방법에 대해 알아보았습니다. 포유류 세포를 키우는 구체적인 방법을 숙지하는 것은 포유류 세포를 이용한 실험을 할 때 매우 중요합니다. 다음 시간부터는 유전자를 분석하고 복제하고, 이를 토대로 단백질을 분석하는 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다.

주1) 통상 Falcon tube라고도 하지만, Falcon tube는 Corning의 브랜드명입니다.
주2) 동결된 세포주가 담긴 바이알을 비닐 봉투에 넣어 수조에 넣거나, 실험용 장갑을 낀 손으로 바이알을 손으로 빠르게 비벼서 세포주를 녹입니다.
주3) 세포가 잘 떨어지지 않을 경우 15분 정도까지 배양기에 두면 대부분 떨어집니다.
주4) 냉동고(-80oC)에서 한번 사용한 동결 속도 조절 챔버는 하루 이상 상온에 두어 상온과 온도 평형을 이루게 한 다음 사용해야 합니다.
주5) 예전에는 멸균한 물에 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride)를 추가하는 경우도 있었습니다만, 호흡기 독성이 있어 연구자에게 위험하므로 권장하지 않습니다.
 

*참고 문헌
1) American Type Culture Collection (ATCC), Animal cell culture guide: tips and techniques for continuous cell lines. https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx
 

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에스프리 (필명)

생명과학 연구를 하다 보면 많은 실험들을 하게 됩니다. 수많은 실험들이 있지만, 그 기반에는 기초적인 실험들이 있습니다. 따라서 기초적인 실험들을 제대로 이해하고 수행하면 다른 실험들도 충분히 이해하고 수행할 수 있게 되며, 결과적으로 연구를 원활하게...

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