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[생명과학자 기초체력 다지기] #4_ELISA
생명과학 이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단) (2020-11-11)

“생명 과학자 기초 체력 다지기” 네번째 주제로 “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”에 대해 알아 보고자 한다. ELISA는 항원-항체 반응을 이용하여 생체시료 중에 포함된 항원 단백질의 양을 정량 하는 방법으로, 항체에 결합된 효소의 활성을 측정함으로써 항원의 양을 분석하는 방법이다. 

 

ELISA

 

ELISA 개요

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)는 생체 시료 중에 존재하는 특정 항원 단백질을 정량적으로 분석하기 위해 가장 널리 사용하는 분석법이다. 이 분석법은 항원-항체 간의 특이적인 결합을 바탕으로 하고 있어 분석 대상은 항체를 생성할 수 있는 것이어야 하고, 분석 대상에 특이적인 항체가 존재하여야 적용이 가능하다.

ELISA 분석법은 항원을 검출하는 방법에 따라 크게 세 가지 (Direct ELISA, Indirect ELISA, Sandwich ELISA)로 나눌 수 있다.

첫번째, “Direct ELISA”는 항원 단백질을 immunoplate에 먼저 결합시킨 후, 효소가 결합된 항체를 사용하여 항원을 직접 검출하는 방법이다. 이 방법은 ELISA 분석법 중 가장 간단한 방법으로, 항원이 적정량 이상으로 보통 감도로 검출이 가능하고, 항원에 대해 이용 가능한 항체가 1종류이고, 항체의 특이성이 높은 경우에 적용하기 적합하다.

두번째, “Indirect ELISA”는 immunoplate 에 항원을 결합시킨 후, 항원 특이적인 “1차 Detection 항체”를 항원에 결합시키고, 효소가 결합된 “2차 Detection 항체”로 항원에 결합된 1차 항체를 검출하는 방법이다.  이 방법은 2차 항체를 사용하여 1차 항체를 다시 한번 선별하는 과정에 특이성이 증가하고, 1차 항체에 2차 항체가 2개 이상 결합할 경우 2차 항체에 의한 신호 증폭이 일어난다. 일반적으로 direct ELISA에 비해 특이성과 감도가 증가한다.

이때 biotin이 결합된 1차 항체를 사용하고, 2차 항체 대신 효소가 결합된 streptavidin을 사용해도 비슷한 효과를 얻을 수 있다. 
 

ELISA


세번째, “Sandwich ELISA”는 immunoplate에 항원 특이적인 “Capture 항체”를 먼저 결합시킨 후, capture 항체에 항원을 결합시킨다. 항원에 “1차 Detection 항체”를 결합시킨 후, 효소가 결합된 “2차 Detection 항체”로 1차 detection 항체를 검출하는 방법이다. 이 방법은 항원의 각각 다른 부위에 결합하는 항체가 최소 2종류 이상 있어야 가능하다. Capture와 detection을 통해 동일한 항원을 2번 선별하게 되므로 항원에 대한 특이성이 세 가지 방법 중 가장 높다. 각각의 step을 통해 신호의 증폭이 일어나 감도도 증가한다.

Immunoplate에 capture 항체를 직접 결합시키지 않고 streptavidin을 먼저 결합시킨 후, biotin-capture 항체를 streptavidin에 결합시켜 사용하는 것도 가능하다. 또한, 항체와 결합하는 protein A, G, 혹은 A/G를 먼저 결합시킨 후, capture 항체를 결합시켜 사용할 수 있다. 이 경우 항체를 직접 결합 시키는 경우 항원 결합 부위가 plate에 결합되어 항원에 대한 결합력이 감소하는 것을 방지할 수 있다. 1차 detection 항체에 효소를 결합시켜 바로 검출하는 것도 가능하다. 1차 항체로 biotin-detection 항체를 사용하고, 2차 항체 대신 효소가 결합된 streptavidin을 사용하여 검출하는 것도 가능하다.
 

ELISA

 

Capture 항체와 Detection 항체는 각각 monoclonal 항체와 polyclonal 항체 중 어떤 것을 사용하는 것이 좋은가? 항원의 종류에 따라 다르긴 하지만 Mono-Mono, Mono-Poly, Poly-Mono, Poly-Poly 모든 조합이 가능하다.

 

그에 앞서 항원과 항체에 대해 잠깐 알아보고 가자.

“항원 (Antigen)”은 면역반응을 통해 항체 생성을 유발하는 물질로 항체가 결합하는 부위인 “Epitope”을 포함하고 있다. Epitope은 단백질 서열의 일부인 “Linear peptide”일 수도 있고, 단백질 “고차 구조”의 일부일 수도 있다.

“항체 (Antibody)”는 항원에 대한 면역반응으로 B 세포에 의해 생성된 항원의 epitope과 결합하는 면역 단백질이다. 하나의 B 세포는 한 종류의 항체만 생산하는데, 단일 클론(monoclone)의 B 세포로부터 만들어져 1 종류의 항체만 포함하는 항체를 “Monoclonal 항체”라 한다. 고분자 단백질은 다양한 epitope을 포함하고 있다. 복수의 클론 (polyclone)으로 구성된 B 세포로부터 만들어진 다양한 종류의 항체 혼합물을 “Polyclonal 항체”라 한다.

Monoclonal 항체는 주로 mouse, rat과 같은 소동물에 항원을 투여하여 항체를 생산하는 B 세포 단일 클론을 선별한 후 암세포와 fusion 시킨 hybridoma 세포를 사용하여 항체를 생산한다. Polyclonal 항체는 혈액량이 많은 sheep, goat, horse, donkey와 같은 대동물에 항원을 투여한 후 혈청으로부터 항원 특이적인 항체를 정제하여 생산한다.

ELISA에 사용하는 항체는 생체시료 중에 존재하는 고차 구조의 항원과 결합하므로, ELISA에 사용 가능한 항체인지 먼저 확인하고 사용해야 한다.

 

다시 capture와 detection 항체의 조합으로 돌아가서, 이론상으론 모든 조합이 가능하지만, “Capture 항체는 monoclonal 항체”, “Detection 항체는 polyclonal 항체”를 사용하는 것이 보다 좋은 조합이 될 수 있다. Monoclonal 항체는 1종류의 epitope만 인식하여 특이성이 높고, polyclonal 항체는 다양한 epitope을 인식하는 항체의 혼합물로 적용 범위가 넓다.

Monoclonal capture 항체의 높은 특이성으로 항원을 1차로 선별하고, polyclonal detection 항체로 항원을 2차 선별함과 동시에, 항원의 다른 epitope에 결합하므로, capture 항체에 결합된 대부분의 항원을 검출하는 것이 가능하다. 반면, capture 항체를 polyclonal로 사용하면, 다양한 capture 항체의 일부는 detection monoclonal 항체의 epitope을 이미 차지해 버릴 수 있다. 이 경우 monoclonal detection 항체가 결합할 자리가 없어져 일부 항원이 검출되지 않게 된다.

 

ELISA 시료

ELISA에 분석에 사용되는 시료는 세포 배양액, 세포 추출물, 혈액 성분, 등 다양하다. 특이성이 높은 항체를 사용하여 시료 중에 포함된 대상 단백질을 선택적으로 검출이 가능하지만, 시료의 종류에 따라 background가 높게 나타날 수 있다. 이러한 경우 분석 시료에서 분석 대상이 아닌 성분을 최소화할 필요가 있다.

“세포 배양액”이 시료인 경우, 무혈청 배지를 사용하여 혈청 성분을 최소화하는 것이 필요하다.

“세포 추출물”은 분석 대상의 위치에 따라 추출 buffer 조성을 달리하여 대상 단백질을 선택적으로 추출하는 방법도 유용하게 사용할 수 있다.

“혈액 성분”은 혈구 세포를 포함한 혈액의 모든 성분을 포함하고 있는 전혈 (Whole blood), 전혈에서 혈구 세포를 제거한 혈장 (Plasma), 전혈에서 혈액 응고를 통해 혈구 세포와 혈액 응고 성분을 제거한 혈청 (Serum)으로 구분된다. 분석 대상이 고분자 단백질인 경우는 혈장, 펩티드와 같이 저분자인 경우는 혈청을 분석 시료로 사용할 수 있다. 고분자 물질들은 혈액응고 시 응고성분들과 함께 소실될 수 있기 때문이다. 불명확할 경우 예비실험을 통해 전혈이나 혈장에 분석 대상 물질을 첨가하여 혈액 응고 후 회수율을 조사한다. 분석 물질이 혈청에 남아 있으면 혈청을 만들어 사용하고 그렇지 않으면 혈장 상태로 사용하면 된다.

 

ELISA 분석 절차

ELISA 분석 절차는 고감도 분석법으로 가장 많이 사용하는 “Sandwich ELISA”를 예를 들어 알아 보자.

ELISA 분석은 총 6 단계 (capture 항체 plate coating, blocking, 시료 항원 단백질 결합, 1차 detection 항체 결합, 2차 detection 항체 결합, 효소에 의한 기질 발색 반응)를 통해 이루어진다.

 

Capture 항체 plate coating

ELISA에 사용하는 plate는 96-well 혹은 384-well format의 “Immunoplate”를 사용한다. 대표적으로 많이 사용하는 immunoplate인 “MaxiSorp” plate는 일반적인 plate에 비해 well의 표면을 매우 균질하고 보다 hydrophilic하게 만들어 항체와 기타 단백질이 일정하게 잘 결합할 수 있도록 만든 것이다.

“Plate coating”은 alkaline buffer (10 mM PBS, pH7.4 또는 50 mM Carbonate buffer, pH9.6)에 “Capture 항체”를 1~10 μg/mL 농도로 만들어 각 well에 100 μL씩 첨가한 후 4℃에서 overnight 동안 반응시킨다.

“ELISA wash buffer”는 PBS 혹은 TBS에 0.05% Tween 20을 첨가하여 사용하며, 각 step 사이에 2~5회 실시한다. Wash step은 각 well에 결합된 비특이적인 결합을 제거하여 background를 감소시키는 역할을 한다.

Coating 후에는 200 μLPBST (0.05% Tween 20)2회 정도 wash한다. 대부분의 단백질은 PBS buffer를 사용하여 coating이 가능하지만, 중성 pH에서 solubility가 낮은 일부 단백질과peptide는 carbonate buffer가 보다 효과적이다. 그 이유는 carbonate buffer의 alkaline pH9.6에서는 대부분의 단백질 혹은 아미노산이 (-) charge를 띠어, (+) charge를 띠는 plate에 보다 효과적으로 결합이 가능하게 되기 때문이다. Capture 항체의 coating 정도는 binding capacity와 관련되므로 titration을 통해 최적의 coating 조건을 확인한 후 진행하는 것이 필요하다. Capture 항체로 monoclonal 항체를 사용하면 항원 특이성은 증가시키고 background 는 감소시킬 수 있다.

 

Blocking

“Blocking”은 plate의 각 well을 capture 항체로 coating하고 난 후, 과량의 단백질을 사용하여 남아 있는 모든 단백질 결합 부위를 masking하여 제거함으로써 detection 항체의 비특이적인 결합을 차단하여 background를 제거한다. Blocking reagent로는 bovine serum albumin (BSA), serum, non-fat dry milk 등이 사용된다. 가장 일반적인 blocking buffer는 1% BSA가 포함된 PBS buffer를 사용하며, plate의 각 well에 200 μL씩 첨가하여 실온에서 1~2시간 혹은 4℃에서 overnight 동안 반응시킨다.

Serum은 immunoglobulin이 제거된 것을 사용하고, 특히 streptavidin을 사용하는 경우에도 biotin이 제거된 것을 사용해야 결합 부위가 masking되는 것을 방지할 수 있다. 그 외 항체와 blocking buffer의 단백질 성분과의 비특이적인 결합으로 인한 background를 최소화하기 위해 Non-protein blocking buffer를 사용하기도 한다. 

 

시료 항원 단백질 결합

항원 단백질이 포함된 생체 시료를 blocking이 완료된 plate의 각 well에 100 μL씩 첨가하여 실온에서 1~2시간 동안 반응시킨다. 이때 생체 시료량, 항원 단백질의 농도, 분석법의 감도, “Matrix effect” (분석 성분 이외의 생체 시료 내 성분이 분석 결과에 영향을 미치는 현상) 정도에 따라 시료 원액을 그대로 사용하거나 희석하여 사용한다.

표준 항원 단백질을 사용한 예비 실험을 통해 분석법의 분석 가능한 농도 범위와 matrix effect가 나타나지 않는 희석 비율을 먼저 결정한다. 시료에 포함된 항원의 농도가 분석 범위를 초과하거나 matrix effect가 클 경우, 시료 중의 예상 항원 농도가 분석 범위 이내이고 matrix effect가 나타나지 않는 농도로 희석하여 사용한다.

시료와 standards는 “duplicate” 혹은 “triplicate”를 사용하여 분석하고, 각 plate마다 “calibration standards”“blank”반드시 포함시켜야 한다. 시료의 양은 calibration standards를 사용한 “standard curve”를 사용하여 정량값을 구한다.

“Calibration standards”는 항원을 포함하지 않은 공시료 (예, 공혈청)에 표준품을 첨가하여 조제하며, “0을 제외하고 최소 6 농도 이상”을 사용하여야 한다. Matrix blank와 zero standard를 포함시켜야 한다.

항원 단백질 결합 후에는 200 μLPBST (0.05% Tween 20)2회 정도 wash한다.

 

1차 Detection 항체 결합

항원 단백질에 특이적인 1차 Detection 항체를 capture 항체에 결합된 항원 단백질에 결합시킨다. 1차 detection 항체의 특이성은 ELISA의 특이성을 결정하는 가장 중요한 요소이다. 1차 detection 항체가 blocking 단백질 혹은 생체 시료의 일부 성분과 결합할 경우 background가 증가된다. 이 경우 blocking 단백질을 포함한 buffer를 사용하거나, 항원 단백질이 포함되지 않은 생체 시료를 사용하여 background를 줄일 수 있다. 예를 들어, 생체 시료가 mouse 혈청인 경우, mouse 공혈청 (normal serum)을 사용하여 1차 detection 항체를 pre-incubation시킨다. 이 과정에 1차 detection 항체 중에 포함된 blocking 혹은 생체시료 성분과 결합하는 비특이적인 항체는 미리 결합되어 ELISA plate에는 결합할 수 없다. Wash 과정에 비특이적인 항체는 제거되어 background가 감소된다. “1차 detection 항체”는 ELISA buffer에 적정 농도로 희석하여 각 well에 100 μL씩 첨가하여 실온에서 2시간 정도 반응시킨다.

1차 detection 항체 반응 후에는 200 μLPBST (0.05% Tween 20)4회 정도 wash한다.

 

2차 Detection 항체 결합

2차 detection 항체는 1차 detection 항체를 생산한 동물의 species와 항체의 isotype에 특이적인 것을 사용한다. 예를 들어, 1차 detection 항체가 rabbit IgG라면 2차 detection 항체는 goat 또는 donkey anti-rabbit IgG 항체를 사용한다. Mouse IgG1이라면, goat 또는 donkey anti-mouse IgG1 항체를 사용한다. “2차 detection 항체”는 ELISA buffer에 적정 농도로 희석한 후, 각 well에 100 μL씩 첨가하여 실온에서 1~2시간 정도 반응시킨다.

2차 detection 항체 반응 후에는 200 μLPBST (0.05% Tween 20)4회 정도 wash한다.

 

효소에 의한 기질 발색 반응

2차 detection 항체는 검출을 위해 효소가 결합된 항체를 사용한다. 가장 일반적으로 사용하는 효소는 Horseradish peroxidase (HRP)와 Alkaline phosphatase (AP)이다.

“HRP”는 hydrogen peroxide를 사용하여 chromogenic substrate (예, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB; 3,3'-diaminobenzidine, DAB; 2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid], ABTS)을 산화시켜 발색을 시키거나, chemiluminescent substrate (예, Luminol)를 산화시켜 발광을 시킨다. HRP는 AP에 비해 분자량이 작아 항체에 대한 결합 비율이 높고, 구조적인 방해 (steric hindrance)가 적다. 반면, 보존제로 사용하는 sodium azide에 의해 저해되므로 주의해야 한다.

“TMB”를 기질로 사용하는 경우 청색 (blue)으로 발색하게 되며, kinetic assay의 경우 650 nm에서 흡광도를 측정한다. Endpoint assay의 경우 stop solution (1 N HCl 혹은 0.6 N sulfuric acid)을 첨가하면 노란색 (yellow)으로 바뀌며, 450 nm에서 흡광도를 측정한다.

“AP”의 가장 일반적인 chromogenic substrate는 p-Nitrophenyl Phosphate (pNPP)로 노란색으로 발색하며, 405 nm에서 흡광도로 측정한다. AP는 HRP에 비해 보다 안정적인데 비해, acidic pH(<pH4.5), EDTA, phosphate에 의해 저해되므로 일반적으로 사용하는 PBS를 사용할 수 없다.

생체 시료 중 적혈구는 peroxidase 활성이 높고, alveolar cell은 AP 활성이 높아 background를 증가시킬 수 있다. 따라서, 효소가 결합된 2차 detection 항체를 결합 시키기 전에 시료 중에 포함된 효소를 불활성화 시키거나 각각 다른 효소를 사용한 검출 방법을 사용하는 것이 필요하다. 

 

ELISA


그 외 효소 대신 형광물질인 sulfo-tag을 결합시켜 MSD (Meso scale discovery)와 같은 장비를 사용하여 Electrochemiluminescence를 측정하는 방법이 있다. 이 경우 효소 반응과 같이 saturation 현상이 없어 보다 넓은 농도 범위에서 측정이 가능하다.

한가지 주의할 사항은, Coating, 시료, 1차/2차 detection 항체 반응 단계는 100 μL, blocking, wash 반응 단계는 200 μL를 사용하고, Coating, blocking, 시료 반응 단계 후 wash는 2회, 1차/2차 detection 반응 단계 후 wash는 4회 반복한다는 점이다.

부피와 횟수는 필요에 따라 증가시킬 수 있지만, 모두 비특이적인 결합은 줄이고 제거 과정은 강화함으로써 background를 감소시킨다는 사실을 기억할 필요가 있다. 
 

[Sandwich ELISA Protocol]

Coating with the capture antibody

  1. Coat the wells of an Immunoplate with the Capture antibody at 1–10 μg/mL concentration in Carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6).
  2. Cover the plate with adhesive plastic and incubate overnight at 4°C.
  3. Remove the Coating solution and wash the plate twice with 200 μL PBST (0.05% Tween 20). The solutions or washes are removed by flicking the plate over a sink. The remaining drops are removed by patting the plate on a paper towel.

 

Blocking and adding samples

  1. Block the remaining protein-binding sites in the coated wells with 200 μL Blocking buffer (2% BSA/PBS) per well.
  2. Cover the plate with adhesive plastic and incubate for at least 1–2 h at room temperature or overnight at 4°C.
  3. Wash the plate twice with 200 µL PBST.
  4. Add 100 μL of diluted Samples to each well. Incubate for 90 min at 37°C.

Optimize the concentration range to obtain a suitable standard curve. Always run samples and standards in duplicate or triplicate with blank in each plate.

  1. Remove samples and wash the plate twice with 200 μL PBST.

 

Incubation with detection and secondary antibody

  1. Add 100 μL of diluted Detection antibody to each well.
    Use the Detection antibody recognizes a different epitope on the target protein to the capture antibody. Use a tested matched pair.
  2. Cover the plate with adhesive plastic and incubate for 2 h at room temperature.
  3. Wash the plate 4 times with PBST.
  4. Add 100 μL of HRP-conjugated Secondary antibody, diluted in blocking buffer immediately before use.
  5. Cover the plate with adhesive plastic and incubate for 1–2 h at room temperature.
  6. Wash the plate 4 times with PBST.

 

Detection (HRP chromogens: TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine))

  1. Add TMB solution with H2O2 to each well, incubate for 15–30 min
  2. Add an equal volume of stop solution (2 M H2SO4)
  3. Measure the OD at 450 nm.

 

참고자료

ELISA wikipedia (https://en.wikipedia.org/wiki/ELISA)

  추천 17
  
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이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)

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  댓글 1 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
네이버회원 작성글 정결  (2022-03-24 21:50)
1
이 시리즈 정말 유용해요ㅜㅜ 많은 도움되었습니다 정말 감사합니다!!
 
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