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[실험을 해봅시다] (5) 세포 키우기-3: 포유류 세포를 키웁시다-1
생명과학 Esprit (2020-11-03)

지난 두 시간에 우리는 ‘세균을 키웁시다’라는 주제로, 세균을 키우는 원리와 방법에 대해 알아봤습니다. 앞서 예고한 바대로, 이번 시간에는 포유류 세포를 키우는 원리를 알아보고, 다음 시간에는 포유류 세포를 키우는 구체적인 방법에 대해 알아보겠습니다. 

포유류 세포는 왜 키울까요? 인간이 포유류라는 사실에 기초합니다. 생명과학을 연구하는 목적 중 하나는 인간의 건강을 비롯한 복리를 증진하는 것이기 때문에, 인간을 구성하는 세포들의 특성을 이해하는 것이 필요합니다. 인간 세포의 특성을 이해하기 위해서는 인간 세포를 체외에서 키우는 것이 필요합니다. 인간 세포를 비롯한 포유류 세포를 체외에서 키우는 것을 바탕으로, 세포생물학 및 생화학 연구가 가능하며, 더 나아가 후보 약물의 특정 세포에 대한 효능 연구도 가능합니다. 한편 세균 세포와 달리 포유류 세포에서는 단백질의 번역 후 수정(post-translational modifications)이 가능하기 때문에 다양한 포유류 유래 물질, 예를 들어 항체 등을 생산할 때도 사용할 수 있습니다. 최근에는 줄기세포나 면역세포 등을 증식시켜 세포 치료제를 만드는 데에도 포유류 세포 배양이 활용됩니다.

포유류 세포를 분류하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 포유류 세포 배양을 할 때는 크게 2가지 방법으로 분류합니다(그림 1). 우선 세포의 부착성에 따른 분류인데, 부착형 세포(adherent cells)와 부유형 세포(suspension cells)로 분류할 수 있습니다. 부착형 세포로는 외피세포(epithelial cells), 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts) 등이 있습니다. 부유형 세포로는 림프구(lymphocytes), 단핵구(monocytes) 등이 있습니다. 다음으로 형질 전환(transformation) 여부에 따라 분류할 수 있습니다. 형질 전환되지 않은 세포들은 세포 분열 횟수가 제한되고, 형질 전환된 세포들은 세포 분열을 무한히 할 수 있습니다. 조직에 존재하는 세포를 분리하여 배양하면, 대부분의 경우 세포 분열 횟수가 제한되어 있습니다주1). 세포 분열 횟수가 제한되는 것은 기본적으로 포유류 세포가 분열할 때 염색체를 복제하는 것이 필요한데, 포유류 세포의 염색체는 선형이고, DNA 중합 효소(DNA polymerase)는 한 방향으로만 DNA를 합성하기 때문에 발생합니다.

이러한 특성으로 인해 포유류 세포의 염색체 말단은 복제되지 않고, 결과적으로 복제된 염색체는 원본 염색체보다 짧아집니다. 만약 아무런 장치가 없으면 염색체가 점점 짧아져서 필요한 유전자가 소실될 것인데, 포유류 세포의 염색체 말단에는 텔로미어(telomere)가 있기 때문에 유전자가 소실되는 것을 막을 수 있습니다. 텔로미어는 염색체 말단에 있는, 반복되는 뉴클레오타이드 서열로서 세포 분열을 거듭하면서 점차 소실됩니다. 세포 분열이 거듭되면서 대부분의 텔로미어가 소실되면 세포 분열이 멈추게 됩니다. 텔로미어가 소실되는 이유 외에도 접촉으로 인한 저해(contact inhibition), 성장 인자(growth factor)의 결핍 등으로 인해 세포 분열 횟수가 제한될 수 있습니다. 하지만 세포에 형질 전환이 일어나면 세포 분열을 무한히 할 수 있게 됩니다. 형질 전환은 자연스럽게 일어날 수도 있고(spontaneous transformation), 화학적으로나 바이러스를 이용하여 일어날 수도 있습니다(chemical or virus-induced transformation). 형질 전환된 세포들은 소실된 텔로미어를 복구시켜주는 텔로머레이즈(telomerase)를 발현하기 때문에 세포 분열을 무한히 할 수 있게 됩니다. 포유류 세포를 이용한 대부분의 실험에서는 형질 전환된 세포를 사용하는데, 무한히 분열할 수 있기 때문에 관리가 비교적 편하기 때문입니다.

 

포유류 세포를 분류하는 방법

그림 1. 포유류 세포를 분류하는 방법. 세포의 부착성에 따라서 부착형 세포와 부유형 세포로 분류할 수 있고, 형질 전환 여부에 따라 분류할 수도 있습니다.


포유류 세포를 배양할 때는 여러 가지 요소들을 고려해야 합니다(그림 2). 우선 배지를 고려해야 합니다. 포유류 세포를 배양할 때 사용하는 배지는 액체 배지로서, 해당 세포가 필요로 하는 영양 - 탄소/수소/산소/질소/인/황 공급원, 염 등- 을 충분히 공급해줄 수 있어야 합니다. 포유류 세포를 배양할 때 많이 사용되는 배지로는 Dulbecco's Minimal Eagle Medium(DMEM), Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI1640), Minimal Eagle Medium(MEM) 등이 있으며, 이들은 구성은 조금씩 다르지만 탄수화물(주로 포도당), 아미노산, 비타민, 무기염류 등을 포함하고 있습니다. 그리고 성장 인자의 공급을 위해 동물 혈청도 사용되는데, 가장 많이 사용되는 것은 우태아혈청(fetal bovine serum(FBS))이고, 통상 56oC에서 30분 두어 혈청 내 존재하는 보체(complement)를 억제시켜 사용합니다1). 우태아혈청의 성분은 화학적으로 명확히 규정되지 않았기 때문에 우태아혈청을 사용하는 배지는 화학 성분이 명확히 규정되지 않은 배지(chemically undefined medium)이고, 배치에 따라 결과가 달라질 수 있습니다. 따라서 화학 성분이 명확히 규정된 배지(chemically defined medium)를 사용하는 경우도 있으나, 아직까지는 우태아혈청 등 동물 유래 성분을 사용하는 경우가 대부분입니다2). 또한 배지에는 pH 조절을 위해서 sodium bicarbonate(NaHCO3)나 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)가 들어가며, pH 변화를 감지하기 위해 지시약인 페놀 레드(phenol red)가 들어가는 경우도 있습니다주2).

한편 포유류 세포를 배양할 때 가장 주의할 점 중 하나가 오염 방지입니다. 오염 방지를 위해 가장 기본이 되는 것은 세포 배양실(culture room)을 따로 두는 것입니다. 세포 배양실은 다른 실험 공간과 격리되어야 하며, 내부에 청정실험대(clean bench), 배양기(incubator), 배지 및 배지 구성 요소들을 보관할 냉장고/냉동고, 세포 상태를 확인할 때 필요한 현미경, 세포 배양에 사용할 물품을 보관할 서랍 등을 갖추고 있어야 합니다. 그리고 세포 배양실에는 자외선 등(UV lamp)가 있어서 사용하지 않을 때는 세포 배양실을 멸균할 수 있도록 해야 하고, 세포 배양실 전용 실험복 및 신발을 두고, 주기적으로 청소하여 외부 오염을 방지해야 합니다. 배지를 만들 때는 배지를 구성하는 성분을 멸균해야 하는데, 대체로 멸균처리기(autoclave)를 사용할 수 없는 성분이 많기 때문에 배지를 구성하는 성분을 혼합한 다음 청정실험대에서 필터하여 사용합니다(주로 0.22 μm pore-sized filter 사용). 다만 배지를 담을 유리병은 멸균처리기를 이용하여 121oC, 15 psi, 15분간 멸균하여 청정실험대에서 사용합니다. 또한 배지를 구성하는 성분이 가루로 되어서 3차 정제수에 녹여서 사용할 경우에는 비커에 3차 정제수, stirring bar를 넣어 멸균처리기에서 멸균하고, 멸균한 3차 정제수를 충분히 식힌 다음 가루로 된 성분을 녹인 다음 청정실험대에서 필터하여 사용합니다. 또한 배지를 만들 때는 주로 penicillin/streptomycin, amphotericin B 등의 항생제를 사용하여 세균이나 진균으로 인한 오염을 방지합니다. 

한편 배양기도 중요합니다. 배양기는 온도 조절, 습도 조절, pH 조절에 반드시 필요합니다. 통상 포유류 세포는 실온보다 높은 37oC에서 잘 성장하기 때문에, 온도 유지를 위해 배양 용기를 배양기에 넣고, 배양기를 잘 닫아야 합니다. 또한 충분한 습도가 있어야(통상 95%) 배지가 지나치게 증발하여 세포가 마르지 않기 때문에, 포유류 세포 배양기에는 물을 공급하는 곳이 있고, 물이 부족한 경우 알람이 울립니다. 미리미리 멸균한 뒤 충분히 식힌 물을 준비하여 알람이 울릴 때 빠르게 보충할 수 있도록 해야 합니다. 마지막으로 pH는 주로 CO2를 이용하여 조절하는데, 통상 배양기에 CO2를 공급하여 5% CO2 조건을 유지하여 사용합니다. Sodium bicarbonate가 배지에 녹으면 Na+와 HCO3-가 되는데, HCO3-는 배지 내의 H+와 반응하여 H2CO3가 됩니다. H2CO3는 CO2와 H2O로 나뉘어 질 수 있습니다. 배지에서 일어나는 두 가지 반응(H+ + HCO3- ↔ H2CO3 ↔ CO2 + H2O)은 서로 평형(equilibrium)을 이루고, 배지에 녹아 있는 CO2는 다시 배지 위의 기체상(gas phase)에 존재하는 CO2와 평형을 이뤄 pH가 조절됩니다. 

마지막으로 배양 용기도 중요합니다. 앞서 포유류 세포에는 부착형 세포와 부유형 세포가 있다고 했는데, 이들을 배양할 때 사용하는 용기는 다릅니다. 부착형 세포의 경우 통상 배양 접시(culture dish)에 배양하는데, 부착할 표면이 필요하기 때문에 배양 접시에는 세포외 기질(extracellular matrix)이 코팅되어 있습니다. 이러한 배양 접시의 특성은 세포외 기질이 코팅되어 있지 않은 페트리 접시(petri dish)와는 구분됩니다. 부유형 세포는 통상 배양 플라스크(culture flask)에 배양하는데, 부착할 표면이 필요 없기 때문에 배양 플라스크에는 세포외 기질이 코팅될 필요가 없습니다. 또한 세포 밀도가 너무 높으면 세포가 배출하는 노폐물이 많이 쌓여서 세포에 악영향을 줄 수 있기 때문에 배양하고자 하는 세포의 수에 따라 배양 용기의 크기를 적절히 선택해야 합니다. 통상 부착형 세포를 배양할 때 많이 사용하는 100 mm 접시에는 (2.2-8.8)x106 개의 세포를, 150 mm 접시에는 (5.0-20.0)x106 개의 세포를 배양할 수 있으며, 부유형 세포를 배양할 때 많이 사용하는 T-75 플라스크에는 (2.1-8.4)x106 개의 세포를, T-175 플라스크에는 (4.9-23.3)x106 개의 세포를 배양합니다3)
 

포유류 세포를 배양할 때 고려할 요소들

그림 2. 포유류 세포를 배양할 때 고려할 요소들. 배양하고자 하는 포유류 세포의특성을 파악하여 배지, 오염 방지, 배양기, 배양 용기를 고려하여 배양하도록 해야 합니다. 


이번 시간에는 포유류 세포를 키우는 원리에 대해 알아보았습니다. 포유류 세포를 배양하는 것은 인간을 구성하는 세포들의 특성을 이해하는데 매우 중요하고, 후보 약물의 효능 연구, 다양한 치료제 개발에도 활용할 수 있습니다. 다음 시간에는 포유류 세포를 키우는 구체적인 방법에 대해 알아보겠습니다.

주1) 대부분의 경우라고 한 것은, 줄기 세포는 조건이 맞으면 계속해서 분열할 수 있기 때문입니다.
주2) 세포 배양에 적합한 pH(통상 pH 7.0-7.4)에서는 페놀 레드가 분홍색-붉은색을 띄며, pH가 6.8보다 낮아지면 노란색을 띕니다. 통상 세포가 배출하는 노폐물이 많이 쌓이면 배지의 pH가 낮아집니다.

 

참고 문헌
1) ThermoFisher Scientific, Heat-inactivated fetal bovine serum. https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs/heat-inactivated-fetal-bovine-serum.html
2) Yao T and Asayama Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reprod Med Biol. 16(2):99-117, 2017
3) ThermoFisher Scientific, Useful information for various sizes of cell culture dishes and flasks. https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/references/gibco-cell-culture-basics/cell-culture-protocols/cell-culture-useful-numbers.html
 

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  댓글 3 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
회원작성글 유먼  (2020-11-28 22:05)
1
좋은 글 잘 읽었습니다.
질문이 있는데요, 저는 colon cancer cell line(epithelial cell)을 키우면서 75T flask를 이용하기도 하고 culture dish를 이용하기도 했는데요, 둘 다 자라는 것이 다르게 느껴지진 않았는데 75T flask와 culture dish에서 키웠을 때 육안으로는 관측이 되지 않는 부분에서 차이가 나타나나요??
회원작성글 Esprit  (2020-12-07 15:38)
2
제가 배양해봤을 때는 부착형 세포의 경우에는 배양 접시에서 배양하는 것이 T75 flask를 이용하는 것보다 더 편했던 거 같습니다. Whole cell lysates를 얻거나 할 때도 좀 더 편하구요.
회원작성글 y3149  (2020-12-08 11:49)
3
유용한 정보 감사합니다 ^^ 재밌게 잘 읽었습니다.
 
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