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[후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #3_Flow Cytometry_실무
생명과학 박은총 (2020-07-13)

지난 연재에서는 Flow cytometry가 어떤 것인지에 대한 이론적인 설명들을 주로 다뤘다면, 이번 연재에서는 Flow cytometry를 이용한 실험에 실질적으로 도움이 될만한 내용들을 다루고자 합니다. 바로 본론으로 들어가도록 하겠습니다.

 

1. Cell culture가 제대로 되어야 한다: Media 색 변화

Flow cytometry를 이용하는 가장 일반적이고 주된 목적은 형광항체를 활용해 단백질 발현을 측정하는 것입니다. 결국 단백질이 제대로 발현되어야 제대로 분석을 할 수 있습니다. 당연한 말이지만, 새내기 대학원생들이 이 부분을 간과하는 것을 종종 보게 됩니다. 결론부터 얘기를 하자면 세포를 키운 Media의 색이 노랗게 되면 십중팔구는 제대로 된 결과를 얻기 어렵습니다.

 

Flow Cytometry_실무

 

Flow Cytometry_실무

왜 Media 색이 노랗게 되면 안 되는지를 설명하도록 하겠습니다. 세포를 배양하는 Media에는 pH Indicator로 Phenol red라는 지시약이 첨가되어있습니다. 해당 지시약 때문에 Media의 pH에 따라 Media 색이 변하게됩니다 (그림 1). Media를 갈아주지 않고 세포를 계속 키우다보면 어느 순간 Media 색이 노랗게 변하는데, 이는 Glycolysis로 인해 생기는 부산물 중 하나인 Lactic acid로 인해 Media pH가 감소하기 때문입니다 (그림 2). 그러면 Media 색이 노랗게 되는 것을 통해 우리는 어떤 정보를 얻을 수 있을까요? Media 색을 변화시킬 만큼 세포로부터 산성의 부산물이 나왔다는 것은 달리 말하면 그만큼 많은 양의 세포호흡이 일어났는 말이며, 이는 결과적으로 영양소가 고갈되었다는 것을 의미합니다. 따라서 노랗게 색이 변한 Media에는 세포가 필요로하는 영양소 거의 고갈되었다고 이해하면 쉽습니다. 그러면 영양소가 고갈되면 세포는 어떻게 반응할까요? 다양한 반응들이 있겠지만, 영양분이 부족하면 단백질 합성이 중단됩니다. 세포는 다양한 에너지를 필요로 하는데, 단백질을 합성하는데 있어서는 단백질을 구성하는 아미노산이 필수적으로 필요합니다. 아미노산이 결핍되면 결과적으로 아미노산 센서인 Gcn2가 활성화되고, 활성화된 Gcn2는 Translation initiation factor인 eIF2α를 비활성화(인산화)시킴으로써 단백질합성 자체가 중단되도록 합니다 (Donnelly et al., 2013). 이러한 세포 내 신호전달을 알지 못하더라도 아미노산이 결핍되면 당연히 단백질을 만들기 어렵게 됩니다. 또한 Glucose가 결핍되어도 다양한 경로를 통해 단백질 합성이 중단되게 됩니다(Zhang et al., 2020). Flow cytometry를 이용해서 단백질을 측정하려고 하는데 단백질 합성이 중단된 상태의 세포를 가지고 실험을 한다면 제대로 된 실험 결과를 얻는 것이 당연히 불가능합니다.

면역학 연구에서는 면역세포를 특정 Subset으로 분화시키고자 며칠동안 in vitro culture 하기도 하고, 조직에서 얻어낸 면역세포의 Cytokine 발현 양상을 보고자 PMA/Ionomycin (P/I) 처리하에 4-5시간 정도의 짧은 시간동안 ex vivo culture 하기도 합니다. 그런데 Media가 감당할 수 있는 능력을 초과하는 양의 세포를 키우게 되면 결국 Media 색이 노랗게 변합니다. 또한 이런 한계는 Cell type/subset에 특이적입니다. 따라서 연구자 본인이 연구하는 세포 타입에 맞게 적절한 세포 수를 결정해야 합니다. 저의 경우 EAE라는 자가면역질환 모델을 연구하는데, 질병이 유도된 마우스의 Spinal cord에서 얻은 세포에는 Th17 cell이라는 세포가 많이 들어있고, 이 세포들은 다른 세포들과 비교할 때 Glucose 의존도가 매우 높습니다. 그래서 다른 세포들의 경우 96-well plate에 1 X 106 cells를 넣어도 괜찮지만, 해당 세포는 1 X 106 cells를 넣고 4 시간동안만 P/I 처리해도 그 사이에 Media가 노랗게 변할 때가 있습니다. 이런 경우에 해당 세포를 Flow cytometry로 분석해보면 Cytokine 합성이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인 할 수 있습니다 (그림 3).
 

Flow Cytometry_실무


만약 실험을 했는데 Media 색이 노랗게 된다면 세포 수를 줄여서 해당 실험은 다시 하는 것을 추천드립니다. 이런 경우에는 앞서 설명한 이유로 인해 단백질 합성이 제대로 일어나지 않고 (영양분의 결핍으로 인한 세포 호흡의 변화는 면역세포 분화에도 영향을 줍니다.), 결국 제대로 된 결과를 얻을 수 없게 됩니다. 따라서 Media 색이 노랗게 되었다면 가능하면 재실험을 추천드립니다. 만약 궁금해서 분석을 해보고싶다면 반드시 연구노트에 Media 색이 노랗게 되었다는 걸 기록해두시고 (사진을 찍어두는 것도 교수님과 Discussion 할 때 도움이 됩니다.) 앞서 설명한 원리에 근거하여 해당 데이터는 이후에 통계처리에서 제외하시기를 추천드립니다.

 

2. FSC와 SSC의 중요성

Flow cytometry로 분석을 할 때는 가장 먼저 FSC와 SSC를 이용하여 세포들을 Gating을 하게 됩니다. FSC(Forward scatter)는 세포의 크기를 알려주는 지표이며, SSC(Side scatter)는 세포의 Granularity를 알려주는 지표입니다. 물론 이 정보를 가지고 어느정도 Lymphocyte, Monocyte, Granulocyte 등등을 크게 구분지을 수 있지만, 단순히 이렇게만 말해서는 크게 도움이 되지 않습니다. 이번 글에서 FSC와 SSC를 통해 강조하고 싶은 것은 1) 죽은 세포 및 불순물(Debris)을 걸러내는 것과 2) 단세포(Singlet)만을 Gating하는 것입니다.

 

1) 죽은세포 및 불순물 거르기

죽은 세포를 제대로 골라내기 위해서는 뒤에서 설명할 Viability dye를 이용해야하지만, FSC/SSC plot에서 일차적으로 골라내주는 작업이 매우 중요합니다. FSC값이 지나치게 작은 세포들은 죽은 세포들이거나 불순물인 경우에 해당합니다 (그림 4). 따라서 이런 세포들은 분석에서 제거해야합니다.

Flow Cytometry_실무

 

2) 뭉쳐있는 세포 거르기 (Doublet discrimination)

Flow cytometry의 핵심 기술 중 하나는 세포를 한 번에 하나씩 흘려보내서 하나씩 분석하는 것입니다. 하지만 이런 기술에도 한계는 존재합니다. 어쩌다보면 세포들이 서로 엉겨붙는 등의 이유로 두 개 이상의 세포가 마치 하나의 세포인 것처럼 분석될 수도 있습니다. 이런 경우 본래 발현해야하는 단백질이 아닌 단백질이 발현되는 것처럼 분석될 수도 있고, 단백질이 실제보다 더 많이 발현되는 것처럼 분석될 수도 있습니다. 따라서 이러한 오류를 제거하기 위해서 단세포(Single cell, 기계가 읽는 신호 관점에서는 Singlet)만을 분석하는 것이 매우 중요하며, Singlet을 Gating하는데는 FSC-H와 FSC-A를 이용합니다. 물론 다른 Parameter를 활용할 수도 있지만, FSC-H vs FSC-A 전략을 소개하도록 하겠습니다.

FSC가 만드는 전기적 신호는 구체적으로 FSC-H(Height), FSC-W(Width), FSC-A(Area)로 구분됩니다. 쉽게 말해서 각각은 세포에 의해 발생하는 신호(Pulse)의 높이, 너비, 면적을 의미한다고 이해하면 쉽습니다. 이론적으로 세포는 구형이기 때문에 하나의 세포가 지나갈 때 갖는 FSC-H와 FSC-A의 값은 비례해서 증가합니다. 하지만 세포가 두 개 이상 붙어서 분석될 경우에는 FSC-H 값에 비해 FSC-A의 값이 더 큰 비율로 증가하게 됩니다 (그림 5). 따라서 이렇게 FSC-A의 값이 FSC-H값에 비해 지나치게 큰 세포들은 제거하고 Singlet만을 분석해야 올바른 분석을 할 수 있습니다.

Flow Cytometry_실무

 

3. Viability dye의 필요성

앞서 FSC/SSC를 이용해 죽은 세포들을 구분해낸다고 했지만, 이 방법으로 죽은 세포들을 다 골라내는 것은 불가능합니다. 일반적으로 생각할 때, Apoptosis가 일어나는 세포를 골라낸다고 생각하면 Annexin V를 떠올립니다. Annexin V는 세포막의 인지질(Phospholipid)중에서 Phosphatidylserine (PS)과 결합하는 물질로서, 세포에서 Apoptosis가 일어날 때 세포막 바깥쪽으로 PS가 재배치되는 원리를 이용해서 Apoptosis가 진행중인 세포를 골라낼 수 있습니다. 따라서 형광 표지된 Annexin V는 PS에 결합되어 Apoptosis 초기의 세포부터 이미 세포막이 망가진 세포까지 모두를 골라낼 수 있지만, 칼슘이 있는 별도의 Buffer를 지속적으로 사용해야한다는 부분에서 매번 Annexin V를 이용해 Flow cytometry sample을 준비하기에는 현실적인 어려움이 있습니다. 이런 이유로 Annexin V와는 조금 다른 원리로 작용하는 Viability dye를 더 많이 사용하고 있습니다.

Flow Cytometry_실무

회사마다 제품명은 다르지만, 지금 설명하고자하는 Viability dye는 단백질에 비특이적으로 결합하는 Fluorescent dye입니다. 그런데 이 Dye는 세포막을 투과하지 못하기 때문에 살아있는 세포의 경우 세포막 바깥 부분만 염색이 됩니다. 반면 이미 세포막의 내구성이 망가진 세포들의 경우, Dye가 세포 내부로 침투하여 세포 내부의 단백질을 염색시키므로 훨씬 더 높은 형광신호를 만들어냅니다 (그림 6). 그림 6에서 보듯이 (물론 일부러 죽은 세포들이 많은 극단적인 예를 가져오긴 했지만) FSC와 SSC로 구분되지 않는 죽은 세포들이 상당히 많은 것을 확인할 수 있습니다. 따라서 Viability dye를 이용하지 않고 분석을 하면 이미 죽은 세포들을 포함한 분석을 하게 되는 것입니다. 상대적으로 저가의 Flow cytometer의 경우 다양한 형광을 측정하는데 한계가 있어서 Viability dye를 추가하기에는 Panel이 모자를 수가 있습니다. 하지만 다양한 형광을 측정할 수 있는 기계라면 반드시 별도의 형광 Viability dye를 이용해서 죽은 세포들을 제외시키고 분석하시기를 추천드립니다. 주로 사용하는 형광항체들과의 호환성을 높이기 위해서 사용빈도가 낮은 형광 Panel을 Viability dye로 이용하면 좋습니다. 이런 이유로 제가 있는 실험실에서는 405 nm/506 nm의 Excitation/Emission spectrum을 갖는 Dye(Viability dye eFluor 506)를 주로 이용하고 있습니다.

 

4. Spillover와 compensation에 대한 바른 이해

이전에 올렸던 Flow cytometry를 소개하는 글에서 형광의 원리에 대해 간략하게 설명했습니다. 형광 Dye가 단파장의 빛에 의해 활성화되고, 그 결과로 단파장의 빛을 내보낸다면 매우 이상적일테지만, 실제로는 꽤 넓은 스펙트럼의 빛에 의해 활성화될 수 있고, 이에 대한 반응으로 스펙트럼을 갖는 빛을 만들어냅니다. 이러한 이유로 Spillover라는 현상이 발생합니다 (그림 7). 간단하게 말하자면 FITC라는 형광물질과 PE라는 형광물질로 동시에 세포를 염색하면 두 형광물질에서 발생한 신호가 서로를 침범하여 분석에 오류를 만드는 것입니다. 따라서 기계가 인식한 빛이 FITC로 부터 온 것인지 PE로부터 온 것인지를 제대로 알 수 있도록 보정하는 과정이 필요하고, 이런 과정을 Compensation이라고 부릅니다. 이에 대한 구체적인 내용들을 이 글에서 자세히 설명하기에는 그 내용이 너무 많아서 해당 내용들을 전부 다룰 수는 없지만, Compensation은 올바른 Flow cytometry 분석을 위해 필수적으로 선행되어야하는 매우 중요한 과정입니다. 따라서 이부분을 잘 모르시면 반드시 개별적으로 찾아보셔서 Compensation을 제대로익히시기를 바랍니다. 이 글에서는 조금 극단적인 예시를 통해 Compensation이 잘못될 경우 분석이 어떻게 달라질 수 있는지를 보여드리고자합니다.

Flow Cytometry_실무

그림 8은 동일한 샘플이 Compensation이 잘못됨으로 인해 다르게 분석될 수 있음을 보여주는 예시입니다. 단백질A가 높게 발현될 수록 단백질B의 발현도 높게 발현된다는 내용이지만, Compensation이 안 되어 단백질A의 형광이 단백질B의 형광으로 Spillover가 일어날 경우 그 내용이 과장될 수 있고, 반대로 Compensation이 너무 되어서 단백질A의 형광신호가 감소하면 단백질A와 단백질B의 상관관계가 사라지게 될 수도 있습니다 (그림 8). 많은 경우에 조심해야하는 부분은 Compensation이 덜 되어서 본래는 없는 상관관계가 마치 양적 상관관계 (Positive correlation)에 있는 것처럼 잘못 분석되는 경우입니다. 분석하고자하는 마커(예시에서는 단백질B)가 예시의 경우처럼 Negative population과 Positive population이 명확히 구분되지 않는 경우에는 특별히 주의를 기울여야 합니다.

Flow Cytometry_실무

올바른 Compensation을 위해서 지켜야하는 규칙들 중에서 개인적으로 가장 중요하다고 여겨지는 세 가지만을 소개하겠습니다.

1) Compensation control로 사용하는 형광은 실제 샘플이 내는 형광보다 밝아야 합니다.

2) 가능하다면 실제로 사용한 형광을 Compensation control로 사용해야합니다. 예를 들어 FITC와 Alexa Fluor 488은 매우 유사한 Excitation/Emission spectrum을 갖지만 결코 같은 형광물질이 아닙니다. 따라서 실제 샘플에 사용된 형광물질이 FITC라면 FITC를 이용해 Compensation하는 것이 정확합니다. 비슷한 예로 APC와 eFluor660, Alexa Fluor 647 들은 비슷하지만 분명히 서로 다른 형광물질들입니다. GFP같은 형광단백질이 사용되었다면 해당 형광단백질을 많이 발현하는 세포를 Compensation control로 사용하는 것이 좋습니다.

3) Tandem Dye (PE-Cy7, PE-eFluor 610, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7 등과 같이 두 개의 형광물질이 붙어서 Donor에서 나오는 Emission이 Receptor의 Excitation으로 작용, FRET 원리를 응용한 Dye)를 사용할 경우에는 반드시 샘플을 염색할 때 사용한 형광항체와 동일한 Batch를 사용해야합니다. 항체 Batch마다 Tandem Dye의 결합비율 및 정도등이 차이가 생기기 때문입니다. 쉽게 말해서 같은 형광 적힌 다른 항체 사용하지 말고 사용한 항체 바로 그 Vial을 사용해야 한다는 말입니다. 아주 중요한 부분입니다.

 

5. Fixation/Permeabilization 방법 변화

저는 Flow cytometry를 이용해서 샘플을 분석할 때 대부분의 경우에 Intracellular cytokine을 분석합니다. 이러한 이유로 거의 늘 Fixation/Permeabilization과정을 거치게 되는데 어떤 Cytokine의 경우 Fixation/Permeabilization 방법을 달리 했을 때 분석이 더 잘 되는 경우가 있습니다. 대부분의 경우에 eBioscience에서 만드는 Fix/Perm Kit를 사용하는데, 어찌된 이유에서인지 이 Kit를 사용해서 in vitro에서 키운 CD4 T cell의 GM-CSF발현을 체크하면 GM-CSF발현이 제대로 확인되지 않습니다. 그런데 어찌된 이유에서인지 회사제품이 아니라 실험실에서 직접 제조한 2% PFA와 Saponin solution (0.05%)을 이용하면 GM-CSF 발현이 잘 측정됩니다 (그림 9). 그 명확한 이유는 잘 모르겠습니다만, 이처럼 Fixation/Permeabilization 방법에 따라 측정되는 정도가 변하는 단백질들이 있습니다. IL-4의 경우도 PFA/Sapoin을 이용하면 조금 더 잘 측정이 됩니다. 연구자들마다 연구하는 단백질들이 다를텐데 혹시 본인이 연구하는 단백질이 분명히 존재함에도 불구하고 Flow cytometry로 측정이 잘 안 될 경우 Fixation/Permeabilization 시약이나 반응 조건(예를 들어 온도)을 바꿔보는 것을 추천합니다. 물론 항상 이 방법으로 문제가 해결되지는 않습니다.

Flow Cytometry_실무

 

6. 형광 Dye의 명칭 이해

형광항체에 붙은 형광물질들은 그 종류가 매우 다양합니다. 또한 제조사마다 이름을 붙이는 방식도 달라서 Flow cytometry를 처음 접하는 연구자들에게는 어떤 형광은 같이 써도 되고 어떤 형광은 같이 써서는 안 되는지 무척이나 헷갈립니다. 따라서 간단하게 몇가지 형광 Dye들을 소개하고자합니다.

기본적으로 4-color flow cytometer에서 지원하는 Panel의 대표격인 FITC(Fluorescein isothiocyanate), PE(Phycoerythrin), APC(Allophycocyanin)정도는 알 것입니다. 이중에서 PE와 APC는 자연에서 유래한 단백질들이며, 다른 형광물질들에 비해 상대적으로 크기도 큽니다.

 

1) Alexa Fluor 시리즈

Alexa Fluor(AF)로 시작하는 형광물질들을 들어보셨을 겁니다. 대표적으로 FITC와 비슷한 스펙트럼을 갖는 AF 488이 있습니다. AF 뒤에 나오는 숫자는 해당 형광 Dye의 최적 Excitation 파장에 해당하는 숫자입니다. Alexa Fluor dye들의 경우 상대적으로 다른 형광물질들에 비해 안정적이라고 알려져있습니다. 이러 이유로 샘플을 슬라이드에 오래 보관하면서 여러 번 현미경으로 찍어야하는 Immunohistochemistry에 Alexa Fluor dye를 많이 사용됩니다. Flow cytometry에서 많이 사용되는 것은 AF 488 (FITC 대체), AF 647(APC 대체), AF 700 정도가 있습니다.

 

2) eFluor 시리즈
eFluor는 eBioscience에서 자체적으로 개발한 형광 Dye에 붙는 이름입니다. Alexa Flour와는 반대로 해당 Dye가 내는 최적의 Emission 파장에 해당하는 숫자가 eFluor 뒤에 붙습니다. eBioscience에서는 Flow cytometry를 위한 다양한 형광항체들을 개발하기 때문에 Flow cytometry에 사용될 수 있는 eFluor 시리즈도 많이 있습니다. 주로 eFluor 450 (Pacific Blue 대체), eFluor 506 (AmCyan 대체), PE-eFluor 610 (PE-Texas Red 대체), PerCP-eFluor 710 (PerCP-Cy5.5), eFluor 660 (APC 대체), APC-eFluor 780 (APC-Cy7 대체) 등이 사용됩니다.

 

BD사에서 만든 Fluorochrome chart를 첨부파일로 올려두었습니다. BD에서 만든 내용이다보니 경쟁사 eBioscience에서 만드는 eFluor 시리즈는 나오지 않지만, 어떤 형광을 같이 사용하면 안 되는지, 어떤 형광이 상대적으로 밝은지 등에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 참고하셔서 연구에 도움이 되길 바랍니다.

 

7. Staining protocol-96-well plate

이 부분은 넣을지 말지 고민을 했었으나, 혹시라도 누군가에게는 도움이 될 수도 있겠다는 생각이 들어서 넣습니다.

똑같은 실험이라고해도 실험실마다 조금씩 방법에 차이가 있습니다. 한국에서 석사를 할 때 Flow cytometry를 위해 세포들을 염색할 때 1.5 ml EP tube를 이용해 하나씩 샘플을 준비했었습니다. 그런데 지금 제가 있는 듀크대학교에서는 96-well plate를 이용하더군요. 샘플의 양이 많은 경우 훨씬 더 빠르게 샘플을 준비할 수 있기 때문에 해당 프로토콜을 소개합니다. 단 Round-bottom (또는 V-bottom) 96-well plate를 사용하셔야합니다.

 

1. 96-well plate를 준비하고 샘플 순서를 Plate lid에 표기합니다. 또한 샘플이 들어갈 Well 테두리를 마커를 이용해 표시해줍니다.

2. 준비된 세포를 각 Well에 넣어줍니다. 세포의 숫자는 1 X 106개를 넘지 않도록 해주며, Volume은 200 ul정도를 넘지 않도록 해주는 것이 좋습니다. 96-well plate의 경우 Well 한 개에 최대 300 ul까지도 들어가지만 거품이 생기거나 조금만 잘못 다룰경우 샘플간의 교차오염이 생길 수 있기 때문에 최대 Volume은 200-250 ul로 맞추는 것이 좋습니다.

3. 1400 rpm 조건에서 4분간 원심분리합니다.

4. Plate를 개수대로 가져간 뒤 (Plate lid를 열고) Plate를 뒤집으면서 한 번 털어줍니다. 주의 할 것은 재빠르게 ‘한 번’만 털어주는 것입니다. Plate가 뒤집어진채로 Paper towel에 ‘한 번’ 살짝 닦아줍니다 (닦는다기보다는 갖다 댄다는 표현이 더 정확합니다). 털어준 즉시 닦아야하며, 뒤집은 Plate를 Paper towel에 두드리면 안 됩니다. 다시 Plate를 똑바로 뒤집어줍니다. 세포가 마치 없어진 것 같지만 그대로 있으니 믿음을 갖고 진행하시면 됩니다.

5. PBS 또는 FACS buffer로 Wash과정이 필요한 경우 200 ul의 Buffer를 넣어주고 Multi-channel pipette으로 세포를 풀어준 뒤, 3-4과정을 반복합니다. 

6. 각 Well에 형광항체가 섞인 Buffer를 100 ul씩 넣어줍니다. 샘플이 많은 경우 Buffer reservoir(ELISA 할 때 사용하는 reservoir)와 Multi-channel pipette을 이용하시면 좋습니다. Reservoir를 사용할 경우 최소 400 ul를 추가로 준비해야합니다.

7. Staining이 끝난 뒤 FACS buffer를 100 ul 넣어준 뒤 3-5과정으로 Wash 해줍니다.

8. 이후 Fixation/Permeabilization과정이 필요한 경우도 같은 원리로 진행합니다.

 

엄청난 비결이 숨겨진 프로토콜은 아니지만 96-well을 이용해서 빠르고 간편하게 Wash 및 Staining 할 수 있는 프로토콜입니다. 이미 이렇게 하고 계신 연구자분들이 있겠지만, 한국에서 석사할 때 저의 경험으로 볼 때는 그렇지 않은 연구실들도 있기 때문에 해당 프로토콜을 공유하였습니다. 개수대에서 털어낸 이후에 세포가 사라진 것 같지만, 이렇게 해서 세포가 사라진적은 한 번도 없으니 믿음을 가지고 하시면 됩니다. 도움이 되길 바랍니다.

 

8. Flow cytometry 관련 유용한 소스들

Flow cytometry 관련해서 유용한 소스들의 링크를 첨부하고 간략한 설명을 덧붙였습니다. 연구에 도움이 되길 바랍니다.

 

1) Bio-Rad Flow Cytometry Basics Guide

https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html

Flow cytometry와 관련된 많은 기초 지식들을 배울 수 있습니다.

 

2) Spectrum Viewer_BD Bioscience

https://www.bdbiosciences.com/en-us/applications/research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer

다양한 형광물질들의 Excitation/Emission spectrum을 보여줄 뿐 아니라 여러 형광물질들의 스펙트럼을 동시에 보여줌으로써 Spillover가 심한지 양호한지를 어느정도 예상할 수 있는 유용한 도구입니다. 직관적인 구성덕분에 사용하기가 편리합니다. 다만 아쉬운 부분은 경쟁사인 eBioscience에서 만드는 eFluor 시리즈는 정보가 없습니다.

 

3) Flourescence SpectraViewer_ThermoFisher

https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html#!/

eBioscience사를 인수한 ThermoFisher Sicentific사에서 제공하는 스펙트럼뷰어입니다. 개인적으로는 위에 소개한 BD사에서 제공하는 뷰어를 조금 더 선호하지만 eFluor 시리즈의 정보를 확인할 때 유용하게 사용할 수 있습니다.

 

4) Bio-Rad Spectraviewer

https://www.bio-rad-antibodies.com/spectraviewer.html

앞서 소개한 두 개의 스펙트럼뷰어와 유사하지만, 두 회사에서 자체적으로 제작하는 형광들에 대한 정보를 모두 포함한다는 점에서 중립적인 스펙트럼뷰어라고 말하고 싶습니다.

 

 

9. 마치는 글

Flow cytometry를 주로 이용해서 실험을 하다보니 그만큼 Flow cytometry에 대해 하고싶은 말이 많은 것 같습니다. 너무 많은 내용을 한 번에 전달하는 것이 오히려 가독성을 해치지는 않을까하는 염려도 있지만, 전해주고싶은 내용이 너무 많아서 글을 준비하다보니 내용이 참 길어졌습니다. 나름 줄이고 줄였는데도 내용이 많은 것을 보면서 투머치토커라는 제 별명이 어느정도 맞다는 생각이 들어 입가에 미소가 지어지네요. 늘 그렇듯이 이 내용들이 누군가에게는 도움이 되길 바라며 글을 마치겠습니다.

 

 

References

Donnelly, N., Gorman, A.M., Gupta, S., and Samali, A. (2013). The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cell Mol Life Sci 70, 3493-3511.

Zhang, C.S., Hardie, D.G., and Lin, S.C. (2020). Glucose Starvation Blocks Translation at Multiple Levels. Cell Metab 31, 217-218.

https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/alexa-fluor/alexa-fluor-dyes-across-the-spectrum.html

https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/efluor-organic-dyes.html

https://www.bdbiosciences.com/documents/Multicolor_Fluorochrome_Guide.pdf

 

 

파일첨부 1: Multicolor_Fluorochrome_Guide.pdf (457 KB)
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박은총 (Duke University)

처음 대학원에서 면역학이란 연구를 시작하던 때를 지금에 와서 돌이켜보면, 그 당시에 누군가가 내게 알려주었다면 연구에 더 많은 도움이 되었겠다고 생각되는 내용들이 있습니다. 이제 막 면역학 연구를 시작하고 있는 석박사생들 및 면역학에 관심을 갖는 학부생...

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  댓글 16 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
회원작성글 bio  (2020-07-13 10:46)
1
신입 대학원생들 필독으로 남기고 싶네요...
회원작성글 1st  (2020-07-13 11:32)
2
오랜 기간 습득하셨을 소중한 정보를 이렇게 알기 쉽게 정리하여 공유해 주시다니.. 투머치토커이신게 감사할 따름이네요! 감사합니다~😊
회원작성글 대연  (2020-07-13 13:37)
3
소중한 정보를 공유해주셔서 감사합니다!!
회원작성글 변서현  (2020-07-13 21:34)
4
혹시 완결내신 후에 책내실 생각 없으신가요ㅎㅎㅎ 저도 면역랩이다보니 후배들에게 필독서로 남기고싶어요...... 혼자서 힘드시면 같이해요ㅠ
회원작성글 랑스  (2020-07-14 10:11)
5
여러 시행착오를 통한 노하우를 이렇게 쏙쏙 알려주시다니. 저장해둬야 할 글이네요. 감사합니다!!
회원작성글 박은총  (2020-07-14 12:37)
6
변서현님, 책을 낼 생각은 현재로서는 없습니다. 좋은 의견 감사합니다^^.
회원작성글 히까루  (2020-07-14 17:27)
7
면역학을 전공했던 사람으로서 정말 좋은 글을 써주셔서 감사합니다!
회원작성글 bluewhale  (2020-07-16 13:49)
8
좋은 내용 공유해주셔서 정말 감사드립니다. 이제 flow cytometry를 시작하는 랩으로서 많은 도움이 될 것 같습니다.
회원작성글 힘들다힘들어  (2020-07-22 16:00)
9
정말 감사합니다. FACS 아직 모르는게 너무 많은데 이렇게 공부하게 되네요!
회원작성글 안깐마늘  (2020-07-28 14:37)
10
항상 저에게 FACS는 너무 어려운 실험기법 중 하나였는데 어디가서 돈 주고 살 수도 없는 내용이네요 ㅜㅜ 직접 겪고 깨달으신 노하우나 팁들만 골라서 친절하게 설명해주셔서 너무 감사합니다!! 앞으로 연구하는데 있어서 많은 도움이 될 것 같아요!
회원작성글 wooh99  (2020-07-31 09:59)
11
감사합니다
회원작성글 슈빠  (2020-09-02 14:35)
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좋은 정보 감사합니다.
회원작성글 암세포  (2020-12-11 21:14)
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근 10년간 본 자료 중 제일 유용하네요..
너무 감사드려요!!

보면서 오늘 ICS/Flow cytometry 분석을 했는데요 여쭤볼게 생겨 이렇게 댓 남깁니다

1.
2% PFA, 0.05% Saponin buffer는 언제 사용하는지 여쭤봐도 될까요?
이번에 ICS하다 보니, fixation(4.2% PFA BD 제품)을 처리하고, permeabilization(Perm/Wash buffer)를 처리하는 두 단계더라구요.. surface(CD4)는 잘 잡혔는데, cytokine이 안 잡혀서 permeabilization쪽 문제라 생각하는데, 추천하신 lab made buffer는 permeabilization시 쓰는지 궁금합니다

2. intracellular cytokine이 안잡히는데 조언 구합니다
splenocyte 분리해서, Th1,2,17 typing하기 위해 P/I(20,1000 ng/ml)+BFA 4hr 처리하고 ICS 진행합니다.
CD4, IFNg, IL-4, IL-17A 잡아서 보구 있구요,
P/I 처리한게 아닌거에 비해 CD4가 감소하는게 보여서 제대로 작용은 한 것 같은데, cytokine이 거의 안 잡히네요 ㅎㅎ permeabilization 문제라 생각하는데, 혹시 조언이 있으시다면 부탁드리겠습니다

다시 한 번 정성글 감사드려요
덕분에 너무 많이 공부했어요 ^^
회원작성글 박은총  (2020-12-12 13:00)
14
암세포님, 질문 감사합니다.

1. 사용하신 BD 제품과 PFA/Saponin은 기본적으로 목적은 동일합니다. BD에서 만든 제품에는 다른 성분들도 들어가있어서 Cytokine및 Transcription factor를 측정하기에 더 좋은 조건으로 Fixation과 Permeabilization을 시켜줍니다. 다만 글에도 적었듯이, 이유는 정확하게 모르겠지만, 어떤 Cytokine들의 경우 회사제품(저희는 eBioscience 제품을 사용합니다)을 사용하는 것보다 랩에서 만든 PFA와 Saponin을 이용하는 경우 더 좋은 시그널이 잡힙니다. In vitro에서 키운 CD4 T cell에서 GM-CSF나 IL-4를 측정할 때 해당 버퍼들(PFA와 Saponin 둘 다 랩에서 만든 것)을 사용합니다.

2. Splenocyte에 존재하는 Th1,2, 17 cell들은 원래 양이 적습니다. 어느정도를 측정하셨는지 모르겠지만, 별도의 염증반응이 없는 마우스에서 얻은 Splenocyte에는 전체 CD4 T cell중 약 1%정도의 Th17 cell(IL-17A)과 2~5%정도의 Th1 cell(IFN-g)이 존재합니다. 원래 양이 적습니다.

개인적으로 Permeabilization은 금방 일어나는 반응이라서 프로토콜대로 잘 사용했다면 (보통 10배 희석해서 사용하는 것으로 제품이 나오지요) 큰 문제가 없을 것으로 생각됩니다. 만약 Cytokine의 MFI자체가 낮은 경우라면 P/I stimulation 자체가 잘 되지 않았을 가능성이 높습니다. 너무 많은 세포를 넣어주었지는 않은지 확인해보시거나 사용하신 PMA와 Inomycin의 활성이 괜찮은지 등을 확인해보시는 것이 좋을 것 같습니다.

추가적인 질문이 있으시면 eunchong.park@duke.edu로 연락주셔도 됩니다.
회원작성글 암세포  (2020-12-12 13:09)
15
정성스런 답변 정말 감사드립니다!
네이버회원 작성글 ev**********  (2020-12-28 16:06)
16
엄청난 노하우의 공유입니다... 이런 자료들을 잘 모으셔서 추후에는 온라인 강의 등으로 사업을 하셔도 성공하실 것 같습니다. 여러 자료들을 찾아보았으나 명쾌하지 않았던 내용들을 오늘에서야 모두 알게 되었습니다. 정말 감사드립니다.
 
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