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[후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #1_Congenic Mouse
생명과학 박은총 (2020-06-10)

후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트에서 첫 번째로 다룰 내용은 실험동물로 널리 사용되는 마우스(Mouse)에 대한 내용입니다. 많은 연구자들이 마우스를 이용해 실험을 하지만, 자신이 사용하는 마우스에 대해 제대로 이해하지 못하고 실험을 하는 경우들을 종종 보게 됩니다. 이번에 소개할 내용은 ‘Congenic mouse’에 대한 내용입니다. 해당 개념과 이 마우스가 면역학 실험에서 어떤 방법으로 사용되는지를 소개하는 것이 이 글의 핵심이며, 이 내용들이 면역학 연구를 하고있는 석박사생들에게 도움이 되기를 바랍니다.

 

1. 들어가는 글: 일란성 쌍둥이를 구분할 수 있는 방법

유전자가 100% 일치하는 일란성 쌍둥이들은 각자의 고유한 습성이나 여러가지 미묘한 차이들이 있지만, 처음 보는 사람들에게는 이들을 서로 구분해내는 것이 여간 쉬운 일만은 아닙니다. 그런데 만약 한 명이 머리에 염색을 하고 있다면, 서로를 구분해내기는 무척 쉬워질 것입니다. 하지만 염색으로 인한 머리색의 변화는 영구적이지 않기 때문에 시간이 지나고 염색된 머리가 사라진다면 둘을 구분하기는 다시 어려워질 것입니다. 이런 문제를 해결하기 위해 머리색에 관여하는 유전자만을 조절해서 한 명의 머리색을 영구적으로 다르게 만든다면 어떨까요? 물론 이런 생각 자체가 어찌보면 현실에서는 우스운 일일 뿐 아니라 가능하지도 않은 일입니다. 그러나 흥미롭게도 우리가 사용하는 실험쥐에서는 이러한 일들이 일어나고 있습니다.
 

uplCongenic Mouse

 

2. Congenic 개념

실험실에서 사용하는 마우스들은 같은 혈통(Strain)끼리 수 많은 세대간의 근친교배(Inbreeding)를 통해 서로간의 유전자가 동일하도록 만든 일종의 Clone들입니다. (비록 깊이 들어가보면 실제로는 100% 일치하지 않지만(Watkins-Chow and Pavan, 2008), 이 글에서 해당 내용은 불필요하다고 여겨져서 다루지 않고 넘어가도록 하겠습니다.) 물론 사람에게서는 일어날 수 없는 않지만, 이들은 부모 자식 형제 할 것 없이 모두가 같은 유전자를 갖습니다. 즉, 태어난 시기만 다를 뿐 이들은 다른 의미에서 모두가 일란성 쌍둥입니다. (쥐의 입장에서 모두가 똑같이 생겼다는 상상을 해보니 무척이나 당혹스럽긴 합니다.) 이처럼 개체간의 유전체가 일치하는 경우를 동계(Syngeneic) 라고 부릅니다. 그러나 실험실에서 널리 사용되는 C57BL/6 마우스와 BALB/c 마우스는 같은 종이지만, 이들의 경우 유전체가 서로 일치하지 않기 때문에 서로에 대해서 동종이형(Allogeneic)이라고 합니다. 동종이형간에는 장기이식을 할 경우 면역 거부 반응이 일어난다는 점에서 서로의 면역체계가 상대를 적으로 인식함을 볼 수 있습니다.

그렇다면 오늘 설명할 내용인 Congenic이란 무엇일까요? Syngeneic의 경우에서 하나의 유전자만이 (정확히는 유전 인근의 유전체 덩어리: linked segment) 차이 나는 경우를 congenic이라고 부릅니다. 앞서 들어가는 글에서 예시를 든 머리색을 결정짓는 유전자만이 다른 쌍둥이라고 생각한다면 이해하기 쉬울 것입니다 (그림 1).

 

3. Congenic mouse 만드는 방법

어떻게 하면 내가 원하는 유전자에서만 차이를 갖는 Congenic 마우스를 만들 수 있을까요? 그 실제적인 과정은 매우 길고 어렵지만, 답은 간단합니다. 우선 내가 원하는 유전자를 갖고있는 마우스와 (공여자: Donor) 내가 필요로 하는 유전적 배경을 갖는 Strain의 마우스 (수여자: Recipient) 를 교배하여 원하는 유전자와 그에 따른 형질이 유입된 마우스를 선별적으로 얻어냅니다. 그 다음에 해당 마우스와 수여자 마우스간의 여러 세대를 거친 Backcrossing을 통해 원하는 유전자만이 선택되어 남고 원하지 않는 공여자의 유전자는 희석되어 사라지도록 만드는 것입니다 (그림 2). 이론적으로는 10회에 걸친 교배를 통해 본래 필요로 하는 수여자의 유전적 배경을 99.9% 회수할 수 있습니다 (1-1/210 = 0.999). 하지만 동물실에서 원하는 마우스를 얻기 위해 오랜 시간 기다려본 대학원생이라면 이 과정이 말처럼 쉽지만은 않다는 것을 알 것입니다.
 

Congenic Mouse

본래 Congenic 마우스를 만드는 목적은 원하는 유전자만을 바꿔치기 하는 (전문적인 용어로는 변이) 것입니다. 하지만 정말 의도된 유전자를 제외한 나머지 유전자는 모두 수여자의 유전자일까요? 어디까지나 그렇다고 가정을 하는 것일 뿐, 실제로는 그렇지 않습니다. 여전히 일부 유전자는 공여자로부터 오게 됩니다(Schalkwyk et al., 2007). 그렇기 때문에 Congenic 마우스를 통해 실험을 할 때는 내가 얻은 결과가 혹시 다른 의도되지 않은 유전자의 변이 때문은 아닌지 생각해볼 필요가 있습니다.

 

4. Congenic 마우스의 사용례: CD45 congenic mouse (B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ)

이러한 Congenic 마우스는 어떤 목적으로 사용할 수 있을까요? Congenic 마우스는 변이시킨 유전자에 따라 매우 다양한 방법으로 응용하여 사용할 수 있습니다. 모든 것을 다 설명할 수는 없기에 면역학 실험에서 많이 사용하는 Congenic 마우스를 한가지 소개하려 합니다.

CD45라는 단백질은 모든 면역세포가 공통적으로 세포 표면에 발현하는 단백질입니다. 흥미롭게도 마우스에서 CD45를 발현하는 유전자는 Ptprca와 Ptprcb라는 두 가지 대립유전자(Allele)가 존재하며, 이 두 대립유전자에 의해 발현되는 CD45 단백질은 각각 CD45.1과 CD45.2로 불립니다. 일반적으로 널리 사용되는 C57BL/6 마우스를 포함한 대부분의 마우스에서는 CD45.2가 발현되지만, SJL 마우스에서는 CD45.1이 발현됩니다. 이 두 단백질은 기능상의 차이는 없다고 알려져 있으며, 세포 표면에 노출되는 부분에서 다섯 개의 아미노산 서열 차이를 보일 뿐입니다(Zebedee et al., 1991). 흥미롭게도 이 다섯 개의 아미노산 서열 차이에 의한 구조적 변화는 서로 다른 단일클론항체(Monoclonal antibody)에 의해 구별될 수 있습니다. 연구자들은 CD45 단백질이 갖는 이러한 성질을 연구에 활용하기 위해서 앞서 설명했던 교배전략을 이용해 CD45.2대신 CD45.1을 발현하는 C57BL/6 배경의 Congenic 마우스를 만들었습니다. 그렇다면 CD45 Congenic 마우스는 면역학 연구에 어떻게 활용할 수 있을까요? 가장 대표적으로 활용되는 것은 Adoptive transfer를 통한 in vivo tracking입니다 (그림 3).

 

Congenic Mouse


면역세포들은 다른 일반적인 세포들과 구별되는 여러가지 특징들이 있습니다. 먼저 한 자리에 머무르기보다는 계속해서 이동한다는 특징이 있습니다. 면역세포의 시기적절한 이동은 외부 병원균에 의한 감염에 저항하기 위해서는 필수적인 요소입니다. 반대로 지나친 면역세포의 조직내 침윤(infiltration)은 오히려 과도한 염증반응을 유발하고 자가면역질환을 일으키는데 일조하기도 합니다. A라는 유전자를 연구하고 있고, 이 유전자는 염증이 일어나고있는 조직으로의  면역세포이동에 관여한다고 가정을 해보도록 하겠습니다. 가장 확실하게 A라는 유전자가 면역세포의 이동에 관여함을 보여줄 수 있는 방법은 A 유전자가 제거된 면역세포와 Wild type (WT) 면역세포를 “동일한 환경의 하나의 체내에서 (in vivo)” 경쟁시켜보는 것일겁니다. 이러한 경쟁을 위해서는 A 유전자가 제거된 Knock out (KO) 마우스와 WT 마우스에서 각각 연구하는 세포를 얻어낸 뒤 제 3의 수여자(recipient) 마우스에 넣어주는 과정이 필요합니다 (Adoptive transfer). 하지만 이미 몸속으로 들어간 세포가 어디에서 왔는지 알기 위해서는 각각의 세포를 표시할 수 있는 방법이 필요합니다. 이러한 목적을 위해 CD45.1과 CD45.2를 발현하는 면역세포를 다음과 같이 활용할 수 있습니다. 우선은 WT 면역세포를 CD45.2를 발현하는 C57BL/6 마우스에서 얻어내고, 추가적인 교배를 통해 A 유전자 KO 면역세포는 CD45.2와 CD45.1을 공동 발현하는 마우스(Heterozygous)에서 얻어냅니다. 그 이후에 같은 숫자의 세포를 CD45.1을 발현하는 마우스(Recipient)에 넣어주고(Adoptive transfer) 염증반응을 유도하면 면역세포들이 조직으로 이동하게 됩니다. 이후에 CD45 발현을 통해 어떤 세포가 조직으로 더 많이 이동했는지를 확인할 수 있습니다. (CD45는 세포표면에 발현되는 분자이기 때문에 Flow cytometry라는 기법을 활용해 쉽게 확인할 수 있습니다.)

면역세포가 갖는 많은 특징들 중에 또 하나 흥미로운 점은 특정 신호에 반응해서 최종적인 기능을 갖는 다양한 세포로 분화한다는 점입니다. 저는 CD4 T cell을 연구하고 있는데, CD4 T cell은 Th1, Th2, Th17, Treg 등등 다양한 Helper T cell subset으로 분화가 이루어집니다. 그리고 이러한 분화에 영향을 주는 요인들은 Cell intrinsic factor와 Cell extrinsic factor로 크게 나눌 수 있을 것입니다. 연구하고 있는 B라는 유전자가 없는 마우스에서 CD4 T cell의 분화 차이가 발견됐다고 가정해보겠습니다. 이 경우 B 유전자의 손실이 다른 세포에 영향을 주고, 이로 인해 생기는 외부적요인의 변화가 (Cell extrinsic factor) CD4 T cell 분화에 영향을 준 것일 수 있습니다. 혹은 CD4 T cell 자체 내부에서 (Cell intrinsic factor) B 유전자의 기능이 필요한 것일 수도 있습니다. 이러한 가능성을 확인하는 방법에도 Congenic 마우스를 활용할 수 있습니다. 서로 다른 CD45 congenic marker를 발현하는 마우스에서 얻은 WT과 KO 면역세포를 공동 수여자에게 넣어준 뒤 분화정도를 비교하는 것이 그 활용방안입니다. 만약 이러한 경우에 WT과 KO CD4 T cell간의 분화차이가 사라진다면, B 유전자 KO 마우스가 보였던 형질은 Cell extrinsic factor에 의한 현상이라고 볼 수 있을 것입니다. 반대로 두 세포가 같은 환경에 있음에도 분화의 차이가 발견된다면, B 유전자가 CD4 T cell 분화에서 Cell intrinsic factor로 작용함을 추가적으로 증명할 수 있게 됩니다. 이 외에도 방사선처리를 한 수여자에게 서로 다른 Congenic marker를 갖는 마우스에게서 얻은 골수를 이식하면, 한 몸에서 WT과 KO세포 모두를 갖는 Chimera mouse를 만드는 것도 가능합니다.

 

5. Congenic 마우스를 활용한 연구에서 유의할 부분

이론적으로 Congenic 마우스는 최초에 의도한 유전자에서만 차이를 가져야합니다. 하지만 실제로는 그렇지가 않다는 것을 간과해서는 안 됩니다. CD45 congenic 마우스와 C57BL/6를 비교한 한 연구에 따르면 최소 45개의 유전자에서 124개의 SNP가 발견되었습니다(Waterstrat et al., 2010). 또한 Congenic 마우스로 예상치 못하게 유입된 유전자의 변이가 Cytomegalovirus 감영에 대한 저항성 차이를 나타내기도 합니다(Jang et al., 2018). 이러한 사실로 미루어 볼 때, Congenic 마우스를 사용한 연구에서 발견된 형질의 차이가 내가 연구하는 유전자가 아닌 제 3의 유전자에 의해 생긴 것일 가능성도 완전히 배제하기란 어렵습니다. 만약 이런 일이 벌어진다면, 이것은 매우 흥미로운 연구가 될 수도 있지만, 반대로 그동안 진행해온 프로젝트의 방향을 잃어버리는 안타까운 일이 될 수도 있기 때문에 Congenic 마우스에 대한 바른 이해와 적용이 필요합니다.

이러한 C57BL/6 마우스와 CD45 congenic 마우스간에 의도치 못하게 생긴 변이의 가능성을 조금이라도 배제하고자, 저는 한 그룹은 CD45.2를 발현하고 (C57BL/6) 다른 한 그룹은 CD45.2와 CD45.1을 모두 발현하도록 (C57BL/6와 CD45 congenic mouse의 교배를 통해 얻은 그룹) 실험을 설계합니다.

 

6. 마치는 글

Congenic 마우스라는 개념은 이미 오래전에 확립된 개념이지만, 면역학 연구에서 세포의 이동, 분화 등등을 연구하기 위해 아직도 사용되는 고전적인 연구방법 중 하나입니다. 처음 대학원에 들어와서 저널 발표를 준비하던 때 골랐던 논문에 나온 이 개념이 제겐 너무나 생소해서 이것을 이해하는데 상당한 시간을 할애했던 기억이 납니다.

실험용 마우스는 매력적인 실험동물입니다. 다양한 마우스 Strain에 대한 이해는 MHC 분자가 면역거부반응을 결정짓는 중요한 인자라는 사실을 발견하게 했습니다(McDevitt and Chinitz, 1969; Zinkernagel and Doherty, 1974). 또한 이전에는 상상도 못했던 Conditional Knock-out 마우스는 이제 더이상 놀라운 기술이라 느껴지지 않을만큼 보편화 되어서 유전자의 기능연구를 가속화하고 있습니다. 이처럼 마우스를 활용한 연구는 계속해서 발전해나갈 것입니다. 마우스를 이용해서 연구를 하고있는 대학원생들이 저의 글을 통해 마우스에 대한 이해도가 조금이라도 확장되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다.

 

참고문헌

- Jang, Y., Gerbec, Z.J., Won, T., Choi, B., Podsiad, A., B, B.M., Malarkannan, S., and Laouar, Y. (2018). Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. J Immunol 200, 1982-1987.
- McDevitt, H.O., and Chinitz, A. (1969). Genetic control of the antibody response: relationship between immune response and histocompatibility (H-2) type. Science 163, 1207-1208.
- Schalkwyk, L.C., Fernandes, C., Nash, M.W., Kurrikoff, K., Vasar, E., and Koks, S. (2007). Interpretation of knockout experiments: the congenic footprint. Genes Brain Behav 6, 299-303.
- Waterstrat, A., Liang, Y., Swiderski, C.F., Shelton, B.J., and Van Zant, G. (2010). Congenic interval of CD45/Ly-5 congenic mice contains multiple genes that may influence hematopoietic stem cell engraftment. Blood 115, 408-417.
- Watkins-Chow, D.E., and Pavan, W.J. (2008). Genomic copy number and expression variation within the C57BL/6J inbred mouse strain. Genome Res 18, 60-66.
- Zebedee, S.L., Barritt, D.S., and Raschke, W.C. (1991). Comparison of mouse Ly5a and Ly5b leucocyte common antigen alleles. Dev Immunol 1, 243-254.
- Zinkernagel, R.M., and Doherty, P.C. (1974). Immunological surveillance against altered self components by sensitised T lymphocytes in lymphocytic choriomeningitis. Nature 251, 547-548.

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박은총 (Duke University)

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  댓글 10 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
회원작성글 유먼  (2020-06-10 21:51)
1
잘 읽었습니다! 유익하네요
회원작성글 하고싶은것하는사람  (2020-06-16 06:55)
2
좋은 글 감사합니다!!
회원작성글 wdf  (2020-06-25 17:04)
3
헷갈리던 부분 중 하나였는데, 쉽고 자세하게 설명해주셔서 감사합니다!
회원작성글 스타트는호텔에서  (2020-06-27 16:38)
4
위 그림 3에서
CD45.1/45.2 세포를 사용하는 이유가
1) 수여자 마우스의 CD45.1/45.1 세포와 구별하고자 인것인지

아니면
2) 다섯번째 단락의 내용처럼 congenic마우스라고 보증할 수 없기 때문에 변이의 가능성을 배제하고자
인것인지

궁금합니다
회원작성글 박은총  (2020-06-30 22:53)
5
질문주신 내용에 답변 드립니다.
우선적로는 말씀해주신 첫 번째 이유대로 세포를 구분하기 위해서 한 개체는 Heterozygous를 사용해야 합니다. 예시에서 사용된 마우스는 총 세 가지 (수여자, 공여자1, 공여자2)이기 때문입니다.
Anti-CD45.1 antibody와 Anti-CD45.2 antibody를 이용해서 staining 뒤 Flow cytometry로 분석하면 각각의 세포가 Single-positive / Douuble-positive / Single-positive로 구분됩니다.

그러면 Heterozygous가 꼭 공여자가 되지 않고 수여자가 되어도 되는 것이 아니냐는 궁금증이 들텐데요, 네 맞습니다. 굳이 수여자가 CD45.1/CD45.1이 되지는 않아도 됩니다. 다만 글에도 살짝 언급을 했고 질문주신대로 혹시 모를 변이의 가능성을 줄이고 혹시라도 C57BL/6 유래 유전자가 해당 변이를 보상할 수 있지는 않을까라는 약간의 기대감에 CD45.2/CD45.2에 대한 대조군으로 CD45.2/CD45.1을 사용합니다. 물론 이렇게 Heterozygous로 만들면 진짜로 변이에 대한 보상을 하는지는 확실하지는 않습니다.

그리고 현실적인 이유가 있습니다. CD45.1와 CD45.2는 Genotyping하기가 쉽지가 않습니다. 일반적으로 실험실에서 PCR 돌린 후 Agarose gel을 이용해 PCR product size를 비교하는 방식이 아니라 Sequencing을 해야하기 때문입니다. 물론 Sequencing 자체가 엄청 비싸지는 않지만 시간과 돈이 드는 것은 사실입니다.

또한 해당 마우스를 얻기까지의 시간의 단축도 큰 이유가 됩니다. 실험에 사용되는 WT mouse는 보통 KO mouse가 가지고 있는 Floxed gene 또는 Cre gene을 포함합니다. 만약 CD45.2/CD45.2 background의 WT mouse를 CD45.1/45.1 background로 만들려면 어찌되었든 CD45.1/CD45.1 mouse와 한 번 이상 교배를 진행해야하고, 그 과정에서 genotyping이 필요합니다. 이 과정에서 교배에 드는 시간/비용을 무시하기가 어렵습니다. 그러나 한 번만 교배하면 무조건 CD45.1/CD45.2 Heterozygous가 나오고, 내가 원하는 Cre gene이 들어가있는지만 확인하면 간단하게 원하는 마우스를 얻어낼 수 있습니다. 이 부분도 큰 이유를 차지합니다.

질문주셔서 감사드리며, 질문에 대한 답이 되었기를 바랍니다.
회원작성글 박은총  (2020-06-30 22:56)
6
답변 내용 부분 정정합니다.
CD45.1/CD45.1 mouse와 한 번 이상 교배를 진행해야하고,

-> 두 번 이상 교배를 진행해야하고,
회원작성글 스타트는호텔에서  (2020-07-02 13:49)
7
답변 감사합니다 이해하는 데 큰 도움이 되었습니다
회원작성글 1st  (2020-07-13 11:33)
8
좋은 정보 감사합니다!
회원작성글 똘똘  (2020-08-24 14:34)
9
올해 석사과정을 졸업하고 다음학기부터 면역학분야로 박사과정을 시작하려고 하는 학생입니다.
연재해주셔서 감사합니다!! 정말 도움이 많이 됩니다!!
앞으로 연재도 기대할께요:-) 감사합니다!!
회원작성글 ㅁㄹ  (2020-11-17 12:33)
10
엄지척입니다ㅠㅠ..!
좋은 연재 감사드립니다..!
 
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