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B형 간염바이러스 생애 재현한 세포배양 플랫폼 개발
의학약학 한국연구재단 (2019-05-13 13:19)

B형 간염바이러스가 환자에게 감염되고 약물에 의해 감소되는 전 과정이 관찰 가능해졌다. 마크 윈디쉬 박사(한국파스퇴르연구소) 연구팀이 간에서 B형 간염바이러스 생활사 전주기를 재현한 세포배양 플랫폼을 개발했다고 한국연구재단은 밝혔다.

전 세계적으로 3억 명 이상이 B형 간염바이러스(HBV)에 감염되어, 만성 간염, 간경화, 간암 등 심각한 간 질환으로 고통 받고 있다. 매년 80만 명 이상의 환자가 사망에 이르지만, 아직까지 B형 간염은 완치가 불가능한 미 충족 의료수요이다.
   ※ 국내의 경우 200만 명 이상이 B형 간염바이러스에 감염되어 있다.

B형 간염을 완치할 새로운 작용기전의 치료제 개발을 위해, 실제 환자의 간에서 발생되는 바이러스의 생활사 전주기에 대한 포괄적인 이해와 연구가 필요하다. 하지만 기존 연구에서는 바이러스 생활사의 일부분만 관찰할 수 있었다.

연구팀이 개발한 세포배양 플랫폼에서는 B형 간염바이러스가 진입, 유전체(게놈) 복제, 방출, 확산되기까지 8주 이상 관찰할 수 있다. 기존 기술에서 극히 제한적이던 연구 범위(1~3주)가 대폭 확대됐다.

특히 환자에게 직접 유래된 바이러스를 배양하여, 환자의 몸속에서 실제로 일어나는 특성들을 재현할 수 있다. 항바이러스제를 투여했을 때 바이러스의 활성 감소도 검증할 수 있다. 소량의 혈액 시료를 가지고 복잡한 정제과정 없이 손쉽게 연구할 수 있다.

마크 윈디쉬 박사는 “그동안 B형 간염바이러스 연구에 제한적이었던, 생활사 탐색이 전주기적으로 가능한 세포배양 플랫폼을 개발했으며, 새로운 작용기전의 만성 B형 간염 치료제 개발에 이용될 가능성이 매우 높다”라고 연구의 의의를 설명했다.

또한, “향후 이 플랫폼을 이용하여 만성 B형 간염 환자의 개인 맞춤형 치료 시스템 적용을 위한 연구를 진행할 계획이다”라고 후속연구 계획을 밝혔다.

이 연구성과는 과학기술정보통신부·한국연구재단 바이오‧의료기술개발사업의 지원으로 수행되었다. ‘저널 오브 헤파톨로지(Journal Of Hepatology)’에 5월 9일 게재되었다.

< 논문명, 저자정보 >

논문명
Efficient long-term amplification of clinical hepatitis B virus isolates after infection of slow proliferating HepG2-NTCP cells
저  자

마크윈디쉬 박사 (교신저자/한국파스퇴르연구소),
알렉산더 코에닉 박사 (제1저자/한국파스퇴르연구소),
양재원 (제1저자/한국파스퇴르연구소) 외 16명

< 연구의 주요내용 >
1. 연구의 필요성

 ○ 전 세계적으로 3억 명이 B형 간염바이러스에 감염되어 있으며, 바이러스로 인한 만성 간염, 간경화, 간암 등의 심각한 간 질환으로 인해 매년 80만 명 이상의 환자가 사망한다. 
 ○ 만성 B형 간염은 완치가 불가능한 미 충족 의료수요이다. 따라서 새로운 작용기전의 치료제 개발을 위해 실제 B형 간염 환자의 간에서의 HBV 생활사에 대한 포괄적인 이해와 연구가 필요한 상황이다.
 ○ 하지만, 기존 실험실 세포배양 모델들은 바이러스 생활사의 일부분만 관찰할 수 있으며, 그 연구 범위가 극히 제한적이었다.
 ○ 이러한 세포배양 모델의 결여로 인해 수십 년 동안 새로운 치료제 개발 및 바이러스 전생활사 연구에 어려움이 있었다. 따라서 바이러스 생활사를 완벽히 재현할 수 있는 새로운 세포 배양기술 연구개발이 절실히 요구되고 있다. HBV 완치를 위한 글로벌 기초 연구자, 임상가, 제약회사 중심의 국제 연합체인 ICE-HBV에서도 관련 프로젝트가 진행되고 있다.

2. 연구내용
 ○ 연구팀은 만성 B형 간염 환자의 혈액샘플을 이용 실제로 간에서 일어나는 특성들을 정확하게 재현할 수 있는 B형 간염바이러스 세포배양 플랫폼 (HepG2-NTCPsec+)을 최초로 개발하였다.
 ○ 환자유래 B형 간염바이러스의 진입—게놈 복제*—방출—확산 모든 생활사 단계를 탐색할 수 있는 세포배양 플랫폼을 확립하였다.
     * 게놈 복제 : 에피좀(염색체와 독립적으로 증식하는 플라스미드) 형성, B형 간염바이러스가 간세포의 핵에 cccDNA를 만들어 만성적인 감염 유도.
 ○ 소량의 B형 간염 환자의 혈액샘플을 사용한 바이러스 세포 감염 및 항바이러스 활성 검증이 가능함을 확인하였다.
 ○ 초저온 전자 현미경(Cryogenic electron microscopy) 분석법 이용하여 완벽한 외형(HBV Dane particle)을 지닌 다량의 감염성 바이러스의 분비를 확인하였다.
 ○ 초기 세포내 바이러스 감염률 10%에서 8주 후 70%까지 바이러스가 확산됨을 HBV 에피좀, HBsAg*, HBeAg*, HBcAg*레벨에서 다양하게 검증하였다. 또한 HBV 중화항체 처리 시 바이러스 확산이 억제되며, 중단 시 바이러스 확산이 재활성화 됨을 관찰하였다.
     * HBsAg : B형 간염 표면 항원 (외피단백질) * HBeAg : B형 간염 e단백질 항원 (e단백질)* HBcAg : B형 간염 항원 (코어단백질)

3. 연구성과/기대효과
 ○ 기초 연구 분야 : 기존 세포 배양 모델에서 제한되었던 감염성 바이러스의 생산 및 방출 그리고 확산 생활사 전주기의 작용기전에 대한 심도 있는 연구가 가능해졌으며, 이를 통하여 새로운 작용기전의 HBV 치료제 개발을 기대할 수 있다.
 ○ 임상학적 연구 분야 : 소량의 만성 B형 간염 환자 혈액을 이용하여 바이러스의 감염성, 안정성, 복제효율 등을 평가하여 위험성에 대하여 예측할 수 있다.  또한, B형 간염 환자의 항바이러스 치료 중 약물 내성 발생 시 환자혈액을 이용하여 대체 치료법에 대한 민감도 검증이 가능할 것으로 기대된다.

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(그림1) 개발된 세포배양 플랫폼에서 B형 간염바이러스의 확산 관찰
(A) B형 간염바이러스 감염 후 8주간의 세포배양을 통해, 바이러스의 확산을 측정함.  또한 다양한 항바이러스제 처리했을 때의 효과를 비교함.
(B) B형 간염 바이러스에 중화 항체(anti-HBs)를 처리했을 때 바이러스의 확산이 억제됨을 면역 형광 염색법을 통하여 이미지화 함. 중화 항체 처리를 중단했을 때 바이러스가 재활성화되어 확산됨.

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(그림2) B형 간염 환자 혈액을 이용해 바이러스 전 생활사를 재현한 세포배양 모식도
소량의 B형 간염 환자의 혈액을 세포배양 플랫폼에 처리하여 바이러스의 진입 – 게놈 복제 - 방출 - 확산의 생활사 전주기를 탐색하는 모식도

연구 이야기

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

2012년 B형 간염바이러스 수용체가 발견되면서 바이러스 생활사 중에서 초기단계를 연구할 수 있는 세포배양모델이 개발되었다. 하지만, 완전한 바이러스 생활사를 연구하기 위해서는 여전히 윤리적 문제 및 고비용의 다루기 복잡한 동물모델에 의존해야만 했다. 따라서 인간의 간세포와 유사하면서 효율적으로 바이러스의 전 생활사를 탐색할 수 있고, 저비용으로 다루기 복잡하지 않은 실험실 B형 간염 세포배양 모델의 필요성과 중요성을 느껴 연구를 시작했다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

B형 간염 수용체를 발현하는 수많은 서로 다른 간암 세포주 클론을 제작하고 세포배양 기법을 최적화했다. 그 중 바이러스 감염되었을 때 바이러스 복제, 자손바이러스 생성 및 분비효율이 높은 세포주 HepG2-NTCPsec+ 클론을 선정하였다. 또한, 개발된 세포주 특성 및 감염성 자손 바이러스의 분비 효율을 9종의 B형 간염바이러스 마커를 이용하여 확인하였고, 초저온 전자현미경, 전사체 분석법, 공초첨 현미경 분석법을 이용하여 세포주의 특성 및 동역학 분석을 진행하였다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

B형 간염 바이러스는 초기 복제률이 느린 바이러스로 숙주인 사람 간에서 감염되어 만성화를 확립하는데 약 8주의 시간이 소요된다. 하지만, 일반적으로 실험실 세포주의 수명은 1주~ 3주로 제한적이어서 B형 간염 바이러스의 자연적인 확산 및 재감염 관찰이 불가능하였다. 연구팀에서는 이를 극복하기 위하여 8주 이상 세포배양 없이 생존 가능한 세포주를 선별하고 장기간의 바이러스 감염 분석법을 확립하였다.

그 다음으로 ‘환자유래’ B형 간염 바이러스의 세포 감염법을 확립하고자 하였다. 하지만, 만성 간염환자의 혈액샘플 공급이 제한적이며, 일반적으로 복잡한 정제과정을 거치더라도 환자유래 바이러스의 감염성이 낮다고 알려져 있다. 이러한 이유로 일반 실험실에서는 환자유래가 아닌 세포유래 B형 바이러스를 이용하여 실험을 진행하고 있는 실정이다. 연구팀은 가톨릭대학교 성모병원, 연세대학교 세브란스 병원 팀과의 공동연구를 통하여 만성 간염환자 혈액샘플을 공급받았다. 새로운 세포배양 플랫폼에서는 복잡한 정제 과정 없이 소량의 혈장만을 이용하여 감염이 가능했다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

최초로 바이러스 생활사의 전주기를 탐색할 수 있는 B형 간염 바이러스 세포배양 (HepG2- NTCPsec+) 플랫폼을 확립하였다. 확립된 세포배양 플랫폼을 이용 감염성 B형 간염 자손 바이러스의 방출 및 근접 세포로의 확산을 확인하였다.

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

연구팀에서 확립한 새로운 B형 간염 바이러스 세포배양 플랫폼은 B형 간염 환자로부터 분리된 소량의 미정제 혈장을 사용하여 환자유래 바이러스의 감염성, 안정성, 복제효율 등을 평가할 수 있다. 

또한, 임상의가 환자에게 적합한 치료법을 결정할 수 있도록 B형 간염 환자의 바이러스에 대한  항바이러스제의 감수성 및 저항성에 대한 평가가 실험실 단위에서 가능하며, B형 간염 환자의 항바이러스 치료 중 약물 내성발생시 바로 환자 혈장으로부터 바이러스를 분리하여 대체 치료법에 대한 항 바이러스제 민감도를 평가할 수 있다.

기초 연구 분야에서는 새로운 B형 간염 바이러스 세포배양 플랫폼을 적용하여 기존 실험실 모델에서 제한되었던 감염성 바이러스의 생산 및 분비 그리고 확산의 생활사 전주기에 대한 심화된 작용기전에 대한 연구가 가능해졌으며, 이를 통하여 HBV 치료제 개발에 적용 새로운 작용기전의 치료제 개발을 기대할 수 있다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은?

임상학적 연구 분야(개인 맞춤형 의료) : 만성 B형 간염과 관련된 한국 바이오뱅크(혈액, 세포 등 인체자원을 수집‧보관해 연구기관 등에 제공하는 프로젝트) 개발에 참여하여 다양한 B형 간염 바이러스에 대한 특성을 분석하고자 한다.

치료제 개발 분야 : B형 간염바이러스를 박멸할 수 있는 새로운 작용기전의 치료제를 개발하고자 한다.

기초 연구 분야: 다중 오믹스(Multi-Omics Analysis) 연구를 진행하여 B형 간염 바이러스의 세포 내 확산에 관여하는 새로운 세포 인자를 검증하고자 한다.

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