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미생물 이용한 희귀 유전자원 정밀탐색 가능해졌다
생명과학 한국생명공학연구원 (2019-01-22 11:06)

한국생명공학연구원(이하 생명硏) 합성생물학전문연구단은 인공 유전자회로 기술 개발을 통해, 서해안 갯벌유래 미생물 유전체군에서 ε-카프로락탐(나일론모노머)을 합성하는 새로운 기능의 효소유전자들을 발견하였다.
   * ε-카프로락탐: 나일론 합성섬유를 생산하는 고리구조의 물질로 석유 기반의 벤젠을 원료로 하여 만들어지나, 유가변동 및 환경문제로 바이오기반의 합성기술의 개발 필요성이 부각됨.
   * 인공 유전자회로기술: 특정 INPUT조건(예: 카프로락탐 발생)에서만 OUTPUT (예: 형광)이 나타나도록 세포기능을 조절하는 DNA설계기술

이 연구는 위 유전자회로를 바이오센서로 이용한 것으로, 자연(갯벌 환경)에서 추출한 유전체군(메타게놈)에서 나일론원료를 합성하는 새로운 효소활성이 감지되면 정량적인 형광신호를 내도록 유전자회로를 제작하여 미생물 세포에 도입한 것이다.

새로운 촉매반응(효소)을 발견하기 위하여 기존에는 세포배양, 효소반응, 물리·화학적 산물분석을 연속하여 반복하는 방법들이 사용되어 왔다. 본 연구의 방법에서는 위 유전자회로를 도입한 세포들을 초미세반응기(femto-liter)로 이용하여 짧은 시간동안 효소 반응을 진행한 후, 사용된 세포들을 세포자동해석․분리장치(FACS ; fluoscence assisted cell sorter)에 1초에 수천 개씩 흘려보내며 높은 형광을 띄는 것을 분리하는 기술이다.

이 방식은 단일세포 수준에서 일어나는 미량의 활성조차도 고감도로 감지하므로 전통적인 분석법이 갖는 민감도 및 속도의 한계를 동시에 극복할 수 있다. 본 연구에서는 이 기술을 갯벌 메타게놈 분석에 적용하여 기존에 알려지지 않은 전혀 새로운 방식의 반응으로 ε-카프로락탐(나일론모노머)을 형성(cyclic amide-forming transamidation)하는 효소 유전자들을 발견하였다. 이 유전자들은 기존에는 다른 효소반응(3-hydroxybutyrate dehydraogenase)에 관련된 유전자들로 알려져 있던 것들이었다. 

생명硏 합성생물학전문연구단(교신저자: 이승구 박사, 제1저자: 염수진 박사)이 수행한 이번 연구는 생명硏의 주요사업, 과학기술정보통신부와 한국연구재단의 C1바이오리파이너리사업, 글로벌프론티어사업 및 중견연구자지원사업의 지원으로 수행되었고, 네이쳐 커뮤니케이션 (Nature Communications)지에 11월 29일자 온라인 판에 게재되었다.
    (논문명: A synthetic microbial biosensor for high throughput screening of lactam biocatalysts)

생명硏 연구팀은 미생물이 주변 환경에 반응하는 과정에 필요한 유전자 발현 촉진 단백질(전사인자; transcription factor)과 DNA조각을 새롭게 조합하여 인공적인 유전자회로를 제작하고, 이를 세포에 도입하여 다양한 생체활성을 정밀 감지하는 새로운 생물분석 기술을 발전시켜 왔다 (GESS: genetically-encoded enzyme screening system, ACS synthetic biology. 2014, 2016, 2018 등).

본 연구는 이러한 방식을 더욱 발전시킨 것으로, 갯벌유래 DNA를 정밀 탐색하여 나일론모노머(카프로락탐)를 합성하는 새로운 효소작용(cyclic amide-forming transamidase)을 발견한 것이다. 

합성생물학전문연구단 이승구 단장은 “최근 유전자회로 기술을 이용하여 대량 유전체자원의 기능을 고속 비교분석하여 합성생물학에 필요한 유전체 설계 능력을 확보하기 위한 경쟁이 치열하다”며 “본 연구팀의 유전자회로기술이 새로운 플라스틱 생합성/분해에 필요한 유전자의 발견이나 C1전환효소 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다”고 밝혔다.

제1저자인 염수진 박사는 “이 연구결과는 기존에 잘 알려진 유전자에서도 새로운 부수적 활성이 발견될 수 있음을 보여주며, 자연에는 DNA서열 정보의 해석을 통한 이해를 넘어서는 더욱 풍부한 다양성이 존재함을 입증한 것이다”고 밝혔다.

연구결과 개요

□ 연구배경
○ 지구생명체 전체의 60%이상을 차지하는 방대한 유전자원인 미생물은 크게는 지구 대기부터 작게는 곤충의 장까지 생명이 존재하는 모든 환경에서 서식한다. 이들은 인체/가축/작물의 주변 또는 내부에서 다른 생명체들이 보유하지 못한 새로운 유전자 기능들을 제공하며 필요한 활성을 증진시키거나 독성물질을 제거하고, C1가스 등 활용이 어려운 탄소자원을 이용할 수 있게 도와준다.
○ 이렇게 광범위한 기능들은 미생물의 유전적 다양성에 따른 것으로, 이를 바이오산업에 활용하기 위해서는 필요한 유전자를 빠르고 정확하게 찾아내는 경제적 대량분석 기술이 필요하다. 그러나 전통적인 분석 방식들은 시간이 걸리거나 부정확하여 급증하고 있는 유전체자원·정보의 분석에 적절하지 않았다. 이는 첨단 유전체분석기술(NGS)을 통한 대량정보의 증가에도 실재 활성이 확인되지 않은 유전자정보들이 증가하는 이유이다.
○ 생명硏 연구팀에서는 토착미생물 유래의 전사인자 단백질들과 DNA조각을 조립하여 다양한 기능의 유전자회로들을 제작하고, 이를 단일세포 내 효소활성 분석에 이용하는 등 새로운 생물분석 기술개발을 진행해 왔다 (GESS: genetically-encoded enzyme screening system, ACS synthetic biology. 2014, 2016, 2018 등). 본 연구는 이러한 유전자회로 기술을 더욱 발전시켜서 자연환경 유래 메타게놈 DNA에서 산업적으로 중요한 신규 효소기능을 발굴하고자 한 것이다.
 
□ 연구내용
○ 나일론은 플라스틱, 식품 포장 재료, 타이어 코드, 카펫을 제조하는 데 광범위하게 사용되고 있다. 나일론6의 합성원료인 카프로락탐은 벤젠에서 출발하는 여러 단계에서 오염물질들을 배출하므로, 이를 대체하는 친환경 기술의 개발 필요성이 강조되어 왔다. 특히 6-아미노카프론산을 카프로락탐으로 전환하는 바이오기술에 대한 관심이 수년 사이에 크게 부각되었으나, 실제 이 효소활성에 대해서는 알려진 바가 많지 않다.
○ 생명硏 연구팀은 대단위 갯벌유전체에서 이 효소활성의 존재를 파악하기 위하여, 카프로락탐을 민감하게 감지할 수 있는 전자조절인자를 먼저 개발하고, 이를 바이오센서로 도입한 새로운 유전자회로인 CL-GESS를 구축하였다. 즉 자연계에 존재하는 니트릴계 물질을 감지하는 전자인자를 개량하여, 락탐계 화합물에 고 특이적으로 반응하는 유전자 회로로 개발하였다. 이 유전자회로는 카프로락탐뿐만 아니라 다양한 락탐, 락톤계 화합물에 대해서도 매우 민감한 반응을 나타낼 수 있었다.
○ 이 유전자회로의 효용을 입증하기 위하여 본 연구팀은 서해갯벌 유래의 메타게놈 라이브러리를 확보한 후, 카프로락탐 감지 유전자회로를 장착한 대장균에 동시에 형질전환하고, 전구체물질인 6-아미노카프론산을 처리하였다. 시료중에 6-아미노카프론산으로부터 카프로락탐을 전환하는 효소가 존재 할 경우 해당 미생물에 형광물질이 정량적으로 발생하도록 하고, 유세포측정기 (FACS)에서 활성이 없는 세포들과 확연히 구분되도록 하여 하루에 백만 개 이상의 미생물을 선별할 수 있었다.
○ 그 결과 새로운 카프로락탐 합성 효소를 자연계에서 분리하는데 성공하였고, 그 구조-기능을 상세히 분석한 결과, 이 효소는 어떤 조효소의 도움도 없이 카프로락탐을 합성하는 새로운 방식의 반응을 기능을 갖는 것으로 확인되었다. 이 효소는 유전자 정보 상 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (3-HBD)로 알려진 효소에 해당하였으며, 실재 활성에서도 하나의 구조에서 이질적인 두 기능을 동시에 나타내는 매우 독특한 다중기능(promiscuous activity)을 나타내었다.
○ 이렇게 상이한 활성이 한 가지 구조에서 동시에 나타나는 것은 전혀 알려지지 않은 것으로서 기존 유전자 정보를 분석하는 것만으로는 알기 더욱 다양한 효소기능이 다양하게 존재할 수 있음을 보여주는 것이다. 본 연구에서는 활성부위 유전자변이를 통하여 새로운 효소활성(cyclic amide-forming transamidase)을 3-HBD활성과 독립적으로 개량시키는 것도 가능함을 증명하였다.

□ 연구성과의 의미
▶ 인공 유전자회로를 이용하여 개별 세포단위 활성을 분석하면 기존의 유전자 정보 분석(annotation)만으로는 예측하기 어려운 새로운 유전자 기능, 즉 다양한 부수적 활성 (promiscuous activity)의 감지가 가능함을 발견
○  본 연구는 자연에는 예측을 뛰어넘는 훨씬 더 다양한 부수적 반응 (promiscuous activity)들이 존재할 수 있으며, 더 민감한 바이오센서기술을 개발하여 이를 분석하면, 기존의 방법적 제약을 넘어 세포내 생화학반응의 다양성을 더욱 넓힐 수 있음을 보여준 의미가 있다.
○ 이 부수적 반응을 방향성 진화 (directed evolution) 및 단백질공학을 통하여 더욱 증진시키면 기존 미생물 및 효소기술로는 어려웠던 새로운 바이오 공정의 개발이나 산업적 가치창출도 가능할 것으로 기대된다.
○ 특히 본 연구에서 제시한 것처럼 기존에 잘 알려진 유전자에서도 새로운 활성이 발견될 수 있으며, 이는 자연에는 통상의 DNA서열 정보의 해석을 통한 이해를 넘어서는 더욱 풍부한 다양성이 존재함을 제시한다.

연구결과  문답

이번 성과 뭐가 다른가

본 유전자회로기술 개발 성과는 유전자원 탐색을 위한 생물분석기술에 속도와 경제성을 부여한 것이었다. 이를 통하여 대량 유전자원의 기능을 빠르게 분석하여 합성생물학에 필요한 유전자를 적절하게 수급할 수 있다. 또한 자연에 널리 존재하는 부수적 효소활성(promiscuous activity)을 계발하여 유용한 생물학적 활성을 창출하는 가능성을 제시하였다.

어디에 쓸 수 있나

본 연구에서는 락탐/락톤에 반응하도록 새로운 유전자회로를 구축하였으며, 유사한 다른 플라스틱 모노머들에도 이용될 수 있다. 플라스틱은 불과 150년 전에 처음 사용되어 천연에는 이들을 생합성하는 유전자도 분해유전자도 거의 진화되어 있지 않다. 본 연구의 대단위 유전자탐색기술은 플라스틱을 생합성하거나 분해하는 기술개발에 활용될 수 있다.

실용화까지 필요한 시간은

본 연구는 자연계에서 새로운 반응의 효소를 발견한 사례로 추가적인 생화학적, 단백질공학적 연구수행을 위한 모델을 제시하는 단계이며, 향후 활성증진 및 생물전환 프로세스 적용을 통하여 구체적인 실용화연구가 추진될 예정이다.

실용화를 위한 과제는

카프로락탐 합성효소의 활성 증진, 대량 발현, 안정성 증진, 고정화 등 다방면의 연구가 필요하다. 최근 이 활성이 다른 계열의 단백질에서도 부수적으로 존재하는 것이 확인되어 활성증진을 진행 중에 있다.

연구를 시작한 계기는

카프로락탐 생산에 따른 환경피해가 국내외에서 알려지고 있는 상황에서 지속가능한 대체기술의 개발필요성이 강조되고 있었다. 생명硏은 ‘유전자회로기술’을 이용한 고속탐색기술에 대한 전문성을 가지고 있는 바, 보유기술을 토대로 바이오프로세스 개발의 난제에 도전하고자 하였다.

에피소드가 있다면

탐색을 통하여 얻어진 유전자서열이 고리화 반응과는 전혀 어울리지 않는 종류의 효소였다. 그러나 특성연구 결과는 이 유전자에서 나오는 것이 확실했다. 결국 3차구조의 분석을 통하여 이 효소의 활성부위에 잘 알려진 3HBD활성 외에도 고리형성 반응을 위한 독특한 활성잔기가 병존하는 것을 제시할 수 있었다. 결국 이론적 해석, 실험적 입증, 화학적 통찰력이 통합되어 현재의 해석을 찾아낼 수 있었다.

꼭 이루고 싶은 목표는

본 연구팀은 고속탐색기술을 위한 유전자회로 개발연구를 오랫동안 수행하고 있다. 최근 다국적 효소전문 기업에서도 본 연구팀의 성과에 관심을 보이기 시작했다. 우리는 이 성과들이 효소 및 생물공정개발이 마주하고 있는 여러 스크리닝 난제들을 해결하는 데 일조하고, 바이오산업 발전을 위한 원천기술로 활용될 수 있도록 하는 것을 목표로 하고 잇다.

신진연구자를 위한 한마디

일이 주는 ‘재미’는 거듭되는 실패에도 의지를 잃지 않고 앞으로 나아가는 원동력이 된다. 이 ‘재미’는 많은 경우 독창성에서 온다. 실용성 있는 일을 재미있게 오래하려면 독창성 있는 아이디어를 찾기 위한 부단한 노력이 필요하다. 오늘의 실패에 지치지 말고 과정에서 ‘재미’를 찾을 수 있기를 바란다.

인공 유전자회로 CL-GESS의 구성도 및 개발과정

그림1.  인공 유전자회로 CL-GESS의 구성도 및 개발과정.
a)는 본 연구의 표적인 카프로락탐(ε-caprolactam) 생성반응을 나타내고, b)는 이를 감지하는 유전자회로를 도식화한 것이다. 즉, 미량이라도 표적활성이 있는 유전체자원이 발견되면 미생물 내 전사인자(NitR)가 이를 감지하여 세포 내 형광으로 표시한다. c)는 이 유전자회로의 부품들을 만드는 과정을 나타낸 것이다. 즉, 1) 카프로락탐에 맞게 전사인자 NitR을 수정하고 2) 표준 프로모터/RBS를 장착하고 3) PnitA프로모터를 가장 단순하게 만들고, 4) 표준 리포터를 적용하였다. 이 회로를 장착한 세포에 유전체자원들과 아미노카프론산(6-aminocaproic acid)을 가하면, 세포 내 유전체자원의 특성이 세포별 형광으로 표시된다.

신규 유전자활성

그림 2. 신규 유전자활성(cyclic amide-forming transamidase)의 검증 및 이를 이용한 유전자회로의 활용 방안.
a)는 신규 유전자활성의 기질인 6-아미노카프론산(6-ACA)를 가한 용액에서 ε-카프로락탐이 발생하는 것을 LC-MS로 감지한 것이다. b)는 이 반응산물을 순수 분리하여 NMR로 검증한 것이다. c)는 이 효소활성을 이용하면 CL-GESS 유전자회로의 감지대상을 세포 내에서 6-ACA를 발생시키는 더욱 다양한 생체반응들로 확장할 수 있음을 나타낸다.

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