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DNA 염기 하나만 바꾼다…첫 동물실험 성공
생명과학 기초과학연구원 (2017-02-28 09:35)

기초과학연구원(IBS) 유전체 교정 연구단 김진수 단장 연구팀이 DNA 염기 하나만을 바꾸는 유전체 교정법 ‘크리스퍼 염기교정 유전자가위(Base Editor, targeted deaminase, 이하 염기교정 유전자가위)’로 생쥐의 특정 유전자 염기를 바꾸는 데 성공했다. 염기교정 유전자가위를 동물에 적용한 첫 사례다.

생명체에 대한 모든 정보를 담고 있는 DNA는 네 개의 염기로 구성되어 있다. 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 염기는 서로 쌍을 이뤄 순서를 만들고 3개의 염기를 조합해 코돈(Codon)으로 유전 정보를 저장한다. DNA 염기서열이 중요한 이유는 단일 염기 하나만 잘못 되어도 심각한 병을 초래하기 때문이다. 낭성 섬유증, 겸상 적혈구 빈혈증 등은 특정 염기 하나가 잘못되어 발생하는 대표적인 유전질환이다.

현재 널리 활용되는 크리스퍼 유전자가위(CRISPR Cas9 혹은 CRISPR Cpf1)는 표적인  DNA 염기서열을 찾아 결합한 뒤 이 부분을 잘라내어 제거하거나, 새로운 염기서열로 교체한다. 이 유전자가위는 두 가닥으로 된 DNA 염기서열을 잘라 유전자를 교정하지만, 특정 염기 한 개를 바꾸는 것은 매우 어려웠다. 한편 지난해 학계에 보고된 염기교정 유전자가위는 염기 하나를 교체할 수 있다는 게 특징이다. 염기교정 유전자가위가 동물 개체수준에서 제대로 작동함을 이번 연구에서 확인한 만큼, 앞으로 난치성 유전질환 연구에 다양하게 활용될 것으로 기대된다.

염기교정 유전자가위는 시토신을 분해하는 탈아미노효소와 DNA를 한 가닥 자르는 Nickase Cas9(nCas9)로 구성된다. 시토신 탈아미노효소가 DNA 서열에서 시토신(C)을 찾아 우라실(U, DNA의 유전정보가 RNA에 전달될 때는 티민이 우라실로 치환)로 바꾸면, 이후 DNA 복구 과정에 따라 우라실(U)은 티민(T)이 된다. 연구진은 이러한 염기 변환으로 정확하게 원하는 형질 변환을 이루는 데 성공했다. 

IBS 연구진은 크리스퍼 염기교정 유전자가위를 전기천공법과 미세주입법을 이용해 생쥐 배아에 전달했다. 근육세포의 안정적 유지에 관여하는 Dystropin (Dmd) 유전자와 멜라닌 색소 형성에 관여하는 Tyrosinase (Tyr) 유전자의 염기 교체를 시도했으며 그 결과, 돌연변이 생쥐를 만드는데 성공했다. Dmd 유전자의 염기를 교체해 근육이 퇴행되는 생쥐를, Tyr 유전자의 염기교체로 백색증(Albino) 유도 생쥐를 만들었다. 또한, 연구진은 전 유전체 시퀀싱으로 표적 위치에만 정확하게 유전자 변이가 발생했음을 확인했다.

이번 연구는 난치성 유전질환 치료제를 위한 형질전환 실험 동물 제작에 큰 도움이 될 것으로 보인다. 이번 연구를 이끈 김진수 단장은 “크리스퍼 염기교정 유전자가위는 일반적인 유전자가위와 달리 DNA 두 가닥을 자르지 않고, 단일 염기를 치환해 정교한 유전자 교정 도구로 활용할 수 있다”며 “이번 연구는 유전질환의 원인이 되는 돌연변이를 배아 수준에서 정밀하게 교정할 수 있는 가능성을 제시한다”고 말했다.

이번 연구결과는 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology, IF 41.514)’ 에 2월 28일 새벽 1시(한국시간) 게재됐다.


연구 내용

논문명/저널명

Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos / Nature Biotechnology

저자정보
Kyoungmi Kim*, Seuk-Min Ryu*, Sang-TaeKim, Gayoung Baek, Daesik Kim, Kayeong Lim, Eugene Chung, Sunghyun Kim, Jin-Soo Kim

연구내용보충설명
■ 지난 해 최초로 보고된 크리스퍼 염기교정 유전자가위는 아직 알려진 것이 많지 않다. 크리스퍼 염기교정 유전자가위는 배아 유전체 교정에서 지금까지 가장 효과적인 유전자가위로 알려진 SpCas9과는 다르게 표적 염기서열 위치만 변이를 일으킨다.
■ 본 연구에서는 염기교정 유전자가위를 최초로 동물에 도입해 특정 유전자의 염기 한 개만 교체하는데 성공했다. 또한, 전장 유전체 분석(Whole genome seq)을 통해 염기교정 유전자가위의 정확성을 최초로 입증했다.

연구 이야기
[연구 배경] 지난해 하버드대학의 데이비드 리우(David Liu) 교수 연구진과 일본 고베 대학의 케이지 니시다(Keiji Nishda) 교수 연구진이 각각 새로운 크리스퍼 염기교정 유전자가위(Base Editor)를 학계에 보고했다. 이를 형질전환 동물 제작에 적용하면 난치성 유전질환 연구 및 치료제 개발 분야에 기여할 수 있을 것으로 예상되었다. 또한 생명과학연구 분야에도 도움이 될 것으로 보여 연구에 착수했다.

[어려웠던 점]  염기교정 유전자가위를 동물에 적용하는 첫 연구였기 때문에 유전체에서 최적화시키는 것이 어려웠다. 생쥐 배아에 염기교정 유전자가위를 전달하고 생쥐가 태어날 때까지 기다릴 경우, 한 달 이상 시간이 소요된다. 본 연구진은 소요시간을 단축하기 위해 배아수준에서 바로 유전체 교정을 확인하는 방식으로 실험 효율을 높였다.

[주목할 점] 이번 연구는 염기교정 유전자가위를 동물 개체 수준에 적용한 첫 연구다. 앞으로 효과적이면서 정확한 유전자 교정을 통해 형질전환 동물들을 만들 수 있음을 방법적으로 제시하고 있다. 돌연변이 동물을 제작하면 유전병의 발병 기전 연구나 치료제 개발에 다방면으로 활용할 수 있다. 또한 이번 연구는 유전질환의 원인이 되는 돌연변이를 배아 수준에서 정밀하게 교정할 수 있다는 가능성을 보여줬다.

[향후 연구계획] 난치성 유전질환 동물 모델을 만들어 질환의 기작 연구 및 치료제 개발에 기여하고자 한다.

크리스퍼 염기교정 유전자가위 개념 및 작동 원리

[그림1] 크리스퍼 염기교정 유전자가위 개념 및 작동 원리

 기존 3세대 크리스퍼 유전자가위(위)와 달리 시토신 탈아미노효소(cytitdine deaminase)가 융합된 크리스퍼 염기교정 유전자가위(아래)는 DNA 서열 중 시토신(C)만 찾아 티민(T)로 교체할 수 있다.
 3세대 크리스퍼 유전자가위의 경우, 가이드 RNA(Guide RNA)가 표적 DNA에 결합하고 절단효소 Cas9이 DNA를 절단한다. 반면 크리스퍼 염기교정 유전자가위는 가이드 RNA가 표적 DNA에 결합하고, nCas9이 DNA의 한 가닥만 자르고 나면 그 사이에 탈아미노효소가 표적 DNA에서 시토신(C)만을 찾아 티민(T)으로 변형한다. 

크리스퍼 염기교정 유전자가위를 이용한 Dystropin 유전자 교정
[그림2]  크리스퍼 염기교정 유전자가위를 이용한 Dystropin 유전자 교정

 연구진은 크리스퍼 염기교정 유전자가위를 생쥐 배아에 주입하여 생쥐의 Dystropin(Dmd) 유전자를 교정하는데 성공했다. 근육세포의 안정적 유지에 관여하는 Dmd 유전자의 염기 중 특정 위치에서 시토신(C)을 티민(T)(좌)으로 치환해 돌연변이 생쥐를 제작했다. 연구진은 변이가 도입된 생쥐(우, 아래쪽)의 경우 Dystropin 단백질이 발현되지 않았음을 확인했다.

크리스퍼 염기교정 유전자가위로 Tyrosinase 유전자가 교정된 생쥐
[그림3] 크리스퍼 염기교정 유전자가위로 Tyrosinase 유전자가 교정된 생쥐

 멜라닌 생성에 관여하는 Tyrosinase 유전자를 교정(좌)하여 만들어진 생쥐(우). 크리스퍼 염기교정 유전자가위로 유전자의 특정위치에서 시토신(C)을 티민(T)으로 치환하였다. 연구진은 전 유전체 시퀀싱 기법을 통해 표적 유전자에만 변이가 도입됨을 확인했으며 일부 생쥐는 눈 색깔이 달라진 것을 관찰했다.

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