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세포 내 폐기물 제거하는 자가포식 과정 상세 규명...고려대 송현규 교수 연구팀
생명과학 한국연구재단 (2014-12-09)

국내 연구진이 세포에 침입한 세균이나 바이러스는 물론 세포 내에서 지속적으로 생성되는 폐기물을 제거하는 단백질 복합체의 구조 및 기능을 밝혀냈다. 

이러한 물질이 원활히 제거되지 못하고 세포내에 축적될 경우 암이나 퇴행성 신경질환 등으로 이어질 수 있어 관련 질병의 이해에 기여할 것으로 기대된다. 

고려대 생명과학부 송현규 교수 연구팀의 이번 연구는 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 중견연구자지원사업(도약)의 지원으로 수행되었고, 제1저자인 김준회 박사과정 연구원은 한국연구재단 글로벌박사펠로우십(GPF)의 지원을 받았다. 연구결과는 자식작용 분야 국제학술지 오토파지(Autophagy) 홈페이지에 11월 14일 미교정본이 게재되었고, 오는 1월 8일 온라인판에 정식 출간될 예정이다.
      (논문명 : Insights into autophagosome maturation revealed by the structures of ATG5 with its interacting partners)

외부 침입자를 제거하고 세포 내에 쌓이는 폐기물을 청소해 세포의 항상성을 유지하는 자식작용*은 질병이나 발생과정과의 연관성이 보고되면서 주목받고 있다.
   * 자식작용(autophagy) : 진핵세포를 침입한 세균, 바이러스 등을 제거하거나 세포소기관 및 폐기물을 제거하여 세포의 항상성을 유지시키는 중요한 생체 반응이다.

 자가포식소체*가 제거할 물질을 둘러싼 뒤 리소좀**과 융합되면서 리소좀에 들어있는 각종 분해효소에 의해 이물질이 분해되는 데 융합구조에 대해서는 밝혀지지 않아 자식작용을 이해하는 데 한계가 있었다.
   * 자가포식소체(autophagosome) : 자식작용에서 제거할 물질을 둘러싸 리소좀에 전달해 주는 이중막으로 구성된 주머니
  ** 리소좀(lysosome) : 산성을 띠는 세포내 주머니 형태의 소기관으로 단백질 분해효소가 들어있어 오래된 세포소기관이나 바이러스나 세균을 파괴한다.

연구팀은 자식작용의 핵심단백질(ATG5*)이 자가포식소체의 형성과 분해 과정에서 각각의 파트너 단백질(ATG16L1, TECPR1)과 만드는 복합체에 대한 고해상도 결정구조를 얻는 데 성공했다. 
   * ATG5 : 자식작용에 관여하는 ATG 단백질들 중 하나로 ATG12 단백질과 공유결합 복합체를 형성한 후에 ATG16 단백질과 함께 E3-리가제의 역할을 한다. 즉, 자식작용에 관여하는 유비퀴틴-유사체인 ATG8 (또는 인체 LC3) 카르복실-말단에 지질을 공유 결합시키는 것을 매개한다.

ATG5가 자가포식소체 형성시에는 ATG16L1과 결합하지만 이후 리소좀과 융합해 분해될 때는 TECPR1과 결합한다는 것이다.  세균이나 바이러스, 세포 내 폐기물의 처리과정에서 핵심역할을 하는 자가포식소체의 형성과 분해기전을 규명함으로써 세포의 항상성과 관련된 여러 질병의 이해에 기여할 것으로 기대된다. 

나아가 연구팀은 주변의 산성도가 ATG5의 결합 파트너를 결정하는데 중요한 변수임을 알아냈다. 리소좀 근처에서의 산성환경이 ATG5와 TECPR1의 결합을 도와 자가포식소체와 리소좀의 융합을 유도한다는 설명이다.  송 교수는 “자가포식소체의 형성과 분해를 조절하는 핵심분자인 ATG5의 작동원리가 규명되어 자가포식소체와 리소좀 융합연구의 활성화를 통한 자식작용이 관여하는 암이나 퇴행성 신경질환과 같은 질병에 대한 이해가 증진될 것”이라고 의의를 밝혔다.


연 구 결 과  개 요


1. 연구배경

자식작용(autophagy)는 1960년대에 쥐의 간세포에서 처음 보고되었으나 본격적으로 연구되기 시작한 것은 1990년대 말 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 전체 염기 서열이 해독되고 일본의 오슈미(Ohsumi) 박사와 미국의 클리온스키(Klionsky) 박사가 자식작용-관련 유전자(autophagy- related genes, Atg genes)들을 동정하면서부터이다.

지난 10여 년 동안 자식작용이 진핵생물(eukaryotes)의 세포 내 폐기물 및 오래된 소기관을 청소하고 박테리아나 바이러스 등 외부 침입자를 제거하여 세포의 항상성을 유지하는데 관여하고 있다는 사실뿐 아니라, 배아 발생 및 퇴행성 뇌신경질환, 암 발생 등과 같은 고등진핵생물에게 일어나는 여러 질환과도 밀접한 관련이 있음을 밝혀냈다.

특히 지난 몇 년간 본 연구진을 비롯한 몇몇 그룹이 자가포식소체의 형성에 중요한 유비퀴틴 유사 경로(ubiquitin-like pathway)에 관련된 단백질들의 구조 및 생화학적 연구를 수행하였으나, 자가포식소체의 분해와 관련해서는 동일한 연구가 아직까지 없어 전체적인 기전을 이해하는데 한계가 있었다.

최근에 ATG5 단백질이 기존에 알려진 ATG16L1과 복합체를 이루어 자가포식소체 형성에 관여하는 것 외에 TECPR1과 복합체를 이룸으로써 완성된 자가포식소체의 리소좀과의 융합에도 관여한다는 것이 보고되면서 관련 단백질 분자들의 구조 및 생화학적 연구를 절실히 필요로 하고 있는 상황이었다.

2. 연구내용

ATG5 단백질과 결합하는 부위인 ATG16L1의 아미노 말단(ATG16N69) 및 TECPR1의 AIR(Atg12-Atg5 interacting region: TECAIR) 부분을 ATG5와 함께 복합체로 결정화에 성공하였고, X-선 회절실험을 통하여 고해상도 구조를 얻음으로써 둘을 비교 분석하였다(그림1a).

구조 정보로 우리는 ATG16L1과 TECPR1이 동일한 방식으로 ATG5와 결합한다는 것을 밝혀냈고(그림1b), 최근 발표된 ATG16L1, TECPR1 및 ATG5가 하나의 복합체로 존재한다는 견해와 ATG16L1과 TECPR1이 ATG5를 두고 상호 배타적인 복합체로 존재한다는 과학계의 논란을 종결하였다. 또한 ATG16N69와 TECAIR의 이소류신(Ile), 류신(Leu), 아르기닌(Arg) 잔기가 ATG5와 상호작용하는 데 중요하다는 것을 발견하였고 다른 종에게서도 이러한 아미노산 서열이 보존되어 있음을 확인하여 ATG5(five) interacting motif, AFIM이라고 명명하였다.

또한 ATG5와 결합하지 못하도록 AFIM의 이소류신, 류신, 아르기닌 잔기를 각각 트립토판, 트립토판, 아스파르트산으로 TECPR1 돌연변이 유전자를 제작하였고 살아있는 세포에 주입하였다. 그 결과 자가포식소체가 리소좀과 융합되지 못하고 세포 안에 축적되어 자식작용에 문제가 생기는 것을 형광현미경 및 전자현미경으로 관찰함으로써 AFIM의 중요성을 in vivo에서도 확인하였다.

한편, ATG16N69와 TECAIR의 ATG5 결합 강도를 생화학적으로 측정하기 위해 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 방법을 통해 화학적으로 합성한 ATG16L1의 펩타이드(A16) 및 TECPR1의 펩타이드(TEC)와 ATG5 단백질간의 결합력을 측정하였다(그림2).

그 결과, 일반적인 세포질의 산성도인 pH 7.4 용액에서는 A16의 ATG5에 대한 결합력이 TEC보다 50배가량 강했지만, 리소좀의 산성도에 근접한 pH 6.0 용액에서는 TEC의 결합력이 150배가량 증가하여 A16과 비슷한 수준을 보였다. 이로써 TECPR1와 ATG5간의 결합에는 주변 환경의 산성도(pH)가 중요하다는 것을 새롭게 밝혀냈다.

이로부터 ATG5는 자가포식소체의 형성과정에서 ATG16L1과 상호작용하지만 자가포식소체의 형성이 끝나고 리소좀과의 융합단계에서는  산성 조건 하에서 TECPR1과 상호작용하여 자가포식소체의 리소좀 분해를 유도한다는 모델을 제시하였다(그림3).

3. 기대효과

자가포식소체와  리소좀의 융합과정의 상세한 분자적 기전을 알 수 있는 계기가 되었으며, 이로 인해 궁극적으로는 자식작용이 관여하는 여러 퇴행성 뇌신경질환 및 암 발생과 같은 인체 질환에 대한 이해가 증진되었다.


연 구 결 과 문 답

이번 성과 뭐가 다른가

자가포식소체 분해 관련 단백질을 순수하게 분리하여 생화학적 연구를 진행하였고, 각 복합체의 고해상도 구조를 규명함으로써 자가포식소체의 형성과 분해기전에 대한 전반적 이해를 도운 것이다.

어디에 쓸 수 있나

더 많은 연구가 필요하지만 자식작용을 억제할 경우 세포사멸(apoptosis)로 이어지기도 한다. 따라서 자가포식소체와 리소좀의 융합을 막으면 세포자살을 유도할 수 있을 것으로 생각된다. 암세포에서만 자식작용을 위한 융합을 막으면 암세포의 자살을 유도하는 방식의 새로운 암치료법 개발을 위한 실마리가 될 수 있을 것이다.

실용화를 위한 과제는

본 연구를 통해 ATG5와 TECPR1의 구조가 명확히 밝혀져 TECPR1 펩타이드 유사체를 구조기반 디자인을 할 수 있다. 이러한 ATG5와 TECPR1간 결합을 막는 저해제를 발굴하면 세포사멸을 유도할 수 있는 저분자 화합물 개발에 이용될 수 있을 것이다.

연구를 시작한 계기는

자가포식소체의 형성과정에 대해서 지난 몇 년간 연구하였는데, 상대적으로 리소좀과 융합되는 과정은 거의 연구가 되어 있지 않다는 것에 착안하여 연구를 시작하게 되었다.

에피소드가 있다면

pH에 따른 결합 강도의 차이는 처음 논문을 투고할 당시에는 몰랐다. 논문심사 과정에서 리뷰어가 제안한 실험을 수행하기 위해 실험조건을 디자인하는 과정에서 우연히 발견할 수 있었다.

꼭 이루고 싶은 목표는

자식작용은 매우 복잡한 과정으로 각 단계의 분자적 기전을 밝혀 관련된 질병의 치료에 도움을 주고 싶다.

신진연구자를 위한 한마디

자식작용 연구는 효모유전학 연구로부터 출발하여 현재 인체 질병 연구의 핵심으로 떠오르고 있다. 지금도 효모를 처음 연구한 학자들이 꾸준히 인용되고 있고 매년 노벨상 후보로 거론되고 있다. 실용화는 기초연구 과정에서 부수적으로 나오는 것이지 그자체가 목적이 되어서는 안 될 것이다.

두 ATG5 단백질복합체들의 삼차원 구조 및 상호작용 방식
그림 1. 두 ATG5 단백질복합체들의 삼차원 구조 및 상호작용 방식
(a) ATG5가 각각  ATG16L1(왼쪽) 및 TECPR1(오른쪽)과 결합한 단백질 복합체 구조로 아미노 말단의 나선구조(주황색)를 포함해 UFD-1(노랑색), HR(연두색), UFD-2(하늘색) 도메인으로 구성되는 ATG5가 왼쪽 그림에서 ATG16L1의 아미노 말단 69개의 아미노산(ATG16N69, 보라색)과 결합하거나 오른쪽 그림에서 AIR이라고 불리는 TECPR1의 45개의 아미노산(TECAIR, 녹색)이 결합한 것을 나타낸다.
(b) 각각의 상호작용을 확대한 그림으로 ATG5와 상호작용하는데 중요한 이소류신(Ile), 류신(Leu), 아르기닌(Arg) 잔기가 ATG16L1과 TECPR1에 공통적으로 존재한다.

산성도 변화에 따른 ATG16L1과 TECPR1의 ATG5 결합 강도 변화

그림 2. 산성도 변화에 따른 ATG16L1과 TECPR1의 ATG5 결합 강도 변화
산성도에 따른 ATG5에 대한 상호작용하는 단백질의 결합 강도를 표면플라즈몬공명(surface plasmon resonance, SPR)을 이용해 비교한 결과 생리식염수 조건(PBS, pH 7.4)에서 ATG16L1 펩타이드(그림 a)와 TECPR1 펩타이드(그림 b)의 ATG5에 대한 결합강도(KD)가 50 배 가량 차이가 나는데 반해 리소좀 산성도에 더 가까운 약산성화 조건(pH 6.0)에서는 TECPR1 펩타이드의 결합강도가 ATG16L1과 유사한 수준으로 나타났다.

자가포식소체와 리소좀 융합기전 모델
그림 3. 자가포식소체와 리소좀 융합기전 모델
자가포식소체(autophagosome, AP)의 형성에는 삼중복합체(ATG12-ATG5-ATG16L1)가 관여한다. 자가포식소체가 완성되면 그 안에 담긴 세포 내 폐기물, 소기관, 박테리아 및 바이러스를 분해하는 리소좀(lysosome, L)과 융합하기 위해 ATG5가 결합상대를 ATG16L1에서 TECPR1으로 바꾸는 데 이 과정에서 리소좀 주변의 낮은 산성도가 두 단백질 간 결합강도를 높이는 역할을 한다. 이 후 물리적으로 가까워진 자가포식소체와 리소좀이 서로 융합, 자가포식소체의 분해가 이루어진다.

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