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바이오통신원   
신경세포 배양 바이오칩 개발...KAIST 바이오및뇌공학과 남윤기 교수와 고려대 의대 선웅 교수 공동연구진
생명과학 한국연구재단 (2014-01-21)

내 연구진이 뇌를 이루는 복잡한 신경회로망의 발달과정을 조절할 수 있는 바이오칩을 개발했다. 바이오칩의 패턴을 달리해 신경세포 연결을 조절할 수 있게 되면 신경세포칩이나 인공 신경회로망 모델 개발 등으로 이어질 수 있을 것으로 기대된다. 
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그림 : 신경세포가 패턴이 없는 칩(왼쪽) 위에서는 무질서하게 뻗어나가는 반면 도트패턴이 있는 칩(가운데 및 오른쪽) 위에서는 도트 패턴을 따라 자라난다. (출처: Lab on a Chip)

 KAIST 바이오및뇌공학과 남윤기 교수, 장민지, 주성훈 연구원과 고려대 의대 선웅 교수, 김운령 연구교수 등이 참여한 이번 연구는 미래창조과학기술부와 한국연구재단이 추진하는 뇌과학원천기술개발사업의 지원으로 수행되었고 연구결과는 국제학술지 랩온어칩(Lab on a Chip)지 2013년 12월 24일자 온라인판에 게재됐다.
     ( 논문명 :  Surface-printed microdot array chips for the quantification of axonal collateral branching of a single neuron in vitro)

하나의 신경세포는 케이블 역할을 하는 축색돌기를 통해 10,000여개 세포와 연결되는데 이때 축색돌기에서 뻗어 나오는 가지*가 제대로 발달되지 않으면 자폐나 퇴행성 질환 등 신경질환을 일으킬 수 있다.
  * 축색돌기가지(axon collateral branch) : 하나의 신경세포에서 만들어진 활동전위가 다른 세포로 전달되는 통로로서 신경회로망 형성이나 재생 등에 관여

이러한 중요성에도 불구하고 신경세포를 시험관에서 배양할 경우 축색돌기가지가 무질서하게 자라, 서로 얽혀 정량적 분석이 어려웠다. 

이에 연구팀은 폴리라이신*이 격자형태의 점들로 촘촘히 찍혀져 있는 손톱크기의 바이오칩을 제작하고 신경세포를 배양한 결과 축색돌기가지가 주로 폴리라이신이 찍힌 점에서 생성되는 것을 알아냈다.
  * 폴리라이신(poly-D-lysine) : 단백질을 구성하는 아미노산 라이신이 다수 연결된 고분자로 생체친화적이어서 신경세포배양 등에 널리 활용된다. 전하를 띄기 때문에 세포가 특정 표면에 접착해서 자랄 수 있도록 돕는다. 

반면 패턴 없이 폴리라이신이 전면에 코팅된 바이오칩에서는 신경세포의 축색돌기가지가 무작위로 뻗어 나갔다.

이 연구결과로 바이오칩의 패턴을 따라 신경세포가 뻗어 나가는 위치와 방향을 제어할 수 있는 가능성을 확인하게 됐다. 

인공 신경회로망 이외에도 암세포나 줄기세포의 증식 같은 세포현상을 제어하는 바이오칩 개발에 응용될 것으로 기대된다. 

실제 폴리라이신이 찍힌 점 위에 신경세포의 가지생성에 관여하는 단백질 액틴, 튜블린 등이 모여 있어 이러한 가능성을 뒷받침한다.

선웅 교수는“축색돌기가지의 생성위치와 성장방향을 정형화해 세포성장에 대한 자동화된 정량분석이 가능해지면 고효율 약물 스크리닝 등에 응용될 수 있을 것”이라고 밝혔다.

연 구 결 과 개 요

1. 연구배경
신경시스템은 수많은 뉴런(neuron)이 복잡하게 구성되어 얽혀있는 신경회로로 구성되어 있다. 뉴런은 축색돌기(axon)과 수상돌기(dendrite)를 통해 다른 세포들과 시냅스(synapse) 연결을 맺고 회로를 형성하는데, 이때 축색돌기가 다른 뉴런으로 신경신호를 전달하는 도선의 역할을 한다. 축색돌기는 신경시스템의 발달과정 중에 점차 성장하면서 뻗어나가는데, 이때 하나의 축색돌기가 다수의 축색돌기가지(axon collateral branch)를 생성하여 한 뉴런이 다른 여러 뉴런과 시냅스를 맺는데 중요한 역할을 한다. 생체 외 배양(in vitro) 조건에서 축색돌기가지의 생성 및 성장 메커니즘을 연구하려는 시도가 계속 있었는데, 배양조건에서는 축색돌기와 거기에서  뻗어 나오는 축색돌기가지가 서로 너무 복잡하게 얽혀 고수율의 정량 분석이 불가능하였다.
본 연구에서는 표면에서 세포의 미세환경을 조절할 수 있는 미세접촉인쇄 기술을 응용하여 신경세포에서 생성되는 축색돌기가지의 생성과 성장을 제어할 수 있는 바이오칩을 개발하고자 하였다.

2. 연구내용
먼저 지름이 5 마이크로미터인 도트를 3, 5, 10 마이크로미터의 간격으로 각각 배열한 바이오칩을 설계하였다. 반도체 공정을 응용한 미세접촉인쇄 기술을 이용하여 생체친화성 고분자 중 하나인 폴리라이신(polylysine)으로 이루어진 도트 패턴을 약 1 x 1 cm 영역에 인쇄하고, 신경세포를 배양하였다.
일반적으로 폴리라이신이 고르게 코팅된 칩 위에서 신경세포를 키우는 경우를 대조군(control)으로 하여 도트패턴이 찍힌 칩 위에서 성장하는 신경세포의 성장 정도를 비교하였을 때, 생성되는 축색돌기의 길이나 축색돌기가지의 개수 등이 대조군과 큰 차이가 나지 않는 것을 확인하였다. 그러나 대조군에서는 축색돌기가지가 무작위적으로 뻗어나오고, 생성된 축색돌기가지와 축색돌기가 이루는 각도가 약 60도인 반면, 도트패턴 칩 위에서 성장한 신경세포의 축색돌기가지는 축색돌기가 지나간 도트패턴 위에서 주로 생성되었으며, 뻗어 나온 축색돌기가지는 축색돌기와 약 90도의 각도를 이루었다.
도트에서 뻗어 나온 축색돌기가지의 생성 메커니즘을 확인하기 위하여, 축색돌기가지의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있는 여러 가지 단백질(actin, tubulin, arp2) 등을 면역염색법(immunocytochemistry)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 도트패턴 위에서 축색돌기의 세포막(membrane)이 도트패턴 영역을 모두 덮을 정도로 팽창되어 있으며, 팽창된 영역 내부에 염색된 단백질들이 집중적으로 모여 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한 축색돌기의 성장을 실시간 세포 이미징(live cell imaging)으로 관찰한 결과, 축색돌기가 도트패턴 위에 잠시 머무르다가 다시 성장하는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 축색돌기 생성 메커니즘으로 알려진 일시정지 현상(pausing phenomenon)과 일치하는 결과이다. 따라서 칩 표면에 구현된 도트 패턴이 축색돌기가지의 생성을 유도할 수 있음을 검증하였다.

3. 기대효과
본 연구는 표면에 구현된 생체친화성 분자 패턴이 신경세포의 성장에 영향을 줄 수 있음을 보여주는 사례이며, 특히 신경회로망의 발달과 재생 등에 중요한 역할을 하는 축색돌기가지의 생성과 성장을 제어할 수 있는 패턴을 개발했다는 점에서 의의가 있다. 또한 개발한 바이오칩은 뉴런에 내재되어있는 생물학적 발달 특성에 큰 영향을 미치지 않으면서, 축색돌기가지의 생성위치를 예측 가능하게 하고 성장 방향을 정렬한다는 장점이 있어 추후 간단한 컴퓨터 분석을 통해 축색돌기가지 성장에 대한 고효율의 정량 분석을 가능하게 할 것이다.


연 구 결 과 문 답

이번 성과 뭐가 다른가

․기존의 신경세포 배양법은 무질서하게 세포가 자라는 반면, 이 기술을 활용하면 보다 질서정연하게 세포를 배양할 수 있음

어디에 쓸 수 있나

․신경세포의 성장 및 분화의 고효율 분석
․신경세포칩

실용화까지 필요한 시간은

․3-5년

실용화를 위한 과제는

․장기간 신경세포 체외배양 유지
․신경세포 종류에 따른 선택성 확보

연구를 시작한 계기는

․신경과학자와 공학자의 융합연구를 통하여 신기술을 만들고자 하는 호기심

에피소드가 있다면

․매주 화상 미팅을 진행하면서 서로 다른 분야의 용어와 개념을 이해하고자 좌충우돌

꼭 이루고 싶은 목표는

․작은 신경칩 위에 사람 뇌와 같은 정교한 신경망 구축

신진연구자를 위한 한마디

․서로 다른 분야의 연구자들과의 소통을 통해 새로운 아이디어가 만들어지는 기쁨을 느껴보세요.

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그림. 도트 패턴 바이오칩 위에서의 축색돌기 가지 성장 및 세포내부 예상 구조
(좌) 도트 패턴이 찍힌 바이오칩 위에 신경세포를 배양하였을 때 성장하는 축색돌기는 도트 패턴(붉은색) 위를 지나가고, 도트 위에서 축색돌기가지(녹색)가 주로 생성된다. 이 경우 생성된 축색돌기가지는 이웃한 도트 패턴으로 성장하여 축색돌기와 90도의 각도를 이루게 된다.
(우) 축색돌기가지가 뻗어 나오는 도트 패턴 위에서 축색돌기의 세포막은 팽창하고, 축색돌기가지 생성에 관여하는 다양한 단백질이 모여 축색돌기가지를 만들어내기 위한 구조를 형성하는 것으로 보인다.


Journal reference
Lab Chip. 2013 Dec 24.
Surface-printed microdot array chips for the quantification of axonal collateral branching of a single neuron in vitro.
Kim WR, Jang MJ, Joo S, Sun W, Nam Y.
  추천 4
  
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