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유전자가위로 생쥐의 특정 유전자를 없애다...연세대 이한웅 교수, 서울대 김진수 교수 공동연구팀
생명과학 교육과학기술부 (2013-01-16)

국내 연구진이 유전자가위 기술로 생쥐 유전자의 단백질 생성기능을 없애는데(knockout) 성공하여, 생체 내 유전자의 기능 연구나 질환동물모델 개발을 가속화하여 신약개발 및 질병연구에 새로운 가능성을 열었다.

연세대 이한웅 교수(53세)와 서울대 김진수 교수(48세)의 공동연구로 진행된 이번 연구는 교육과학기술부(장관 이주호)와 한국연구재단(이사장 이승종)이 추진하는 리더연구자지원사업(창의적 연구), 미래기반기술개발사업, 중견연구자지원사업(도약연구), 일반연구자지원사업(모험연구) 등의 지원으로 수행되었고, 세계 최고 권위의 과학전문지 ‘네이처’의 자매지인 ‘Nature Biotechnology(IF=23)’최신호(1월 10일자)에 발표되었다.
      (논문명: Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting)  

이한웅, 김진수 교수 연구팀은 유전자가위 기술로 생쥐의 특정 유전자에 돌연변이를 일으켜 단백질을 만들어내지 못하도록 하는데 성공하였다.  

유전자가위(engineered nuclease)는 특정 DNA 염기서열을 인식해 절단하는 인공 효소로서, 사람을 비롯한 동식물 세포의 어떤 유전자라도 돌연변이를 교정하거나 특정 유전자를 녹아웃하는데 사용된다. 유전자가위에는 징크핑거 뉴클레아제*와 탈렌(탈·이펙터 뉴클레아제) 등 두 종류가 있다.
     * 징크핑거 뉴클레아제(ZFN)와 탈·이펙터 뉴클레아제(탈렌, TALEN) : 징크핑거와 탈·이펙터는 모두 특정 DNA 염기서열을 인식할 수 있는 인위적인 단백질로, 여기에 DNA를 자를 수 있는 효소(뉴클리아제)를 연결하여 원하는 유전자를 마음대로 자를 수 있음. 최근 연구는 탈렌이 ZFN에 비해 효율과 안전성 면에서 장점이 많다고 밝혀짐

배아줄기세포를 이용하는 기존의 녹아웃 기술(2007년 노벨생리학상 수여 분야)로 녹아웃 생쥐를 만들기 위해서는 우선 유전자변형 배아줄기세포주를 확립한 후, 유전자가 변형된 쥐들로부터 다시 교배되어 얻은 2세대로 유전자변형이 전달되는지를 확인해야 하는 등 복잡하고 비효율적인 과정을 거쳐 대략 1~2년의 긴 기간이 필요했다. 

그러나 연구팀의 유전자가위 기술은 줄기세포를 사용하지 않고 수정란에 직접 주입하기 때문에 6개월 이내에 녹아웃 생쥐를 만들 수 있다. 

연구팀은 특정 유전자(Pibf1과 Sepw1를 모델로 사용)의 염기서열만을 인식할 수 있는 탈렌을 각각 제작한 후, 생쥐의 세포주와 수정란에 직접 주입하였다. 그 결과 해당 유전자 부분에만 정상 쥐의 유전자와는 다른 변이가 발생했고, 변이된 유전자가 후손들에게 안정적으로 유전되는 것을 확인하였다. 따라서 탈렌은 우리가 원하는 특정 유전자만 녹아웃된 동물모델을 만드는데 매우 효율적이고 유용한 방법임을 입증하였다.

이한웅 교수는 “향후 이 기술로 지금까지 제한된 녹아웃 생쥐 생산을 획기적으로 향상시켜 의생명 분야의 연구를 가속화하는데 크게 기여할 것으로 기대한다”라고 연구의의를 밝혔다. 

또한 김진수 교수는 “유전자가위 기술은 유전자의 염기서열을 교정하거나 특정 유전자를 녹아웃하는 등 최근 과학자들이 주목하는 신기술이다”라고 정의하였다.

연 구 결 과 개 요

Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting
(탈렌에 의해 매개되는 유전자 적중에 의한 유전자 녹아웃 생쥐의 생산)
 
I. 서론

 최근 유전자 가위인 Zinc-finger nuclease (ZFN)와 Transcription Activator-Like Effector (TALE) Nuclease (TALEN) 기술이 급속도로 발전하고 있다. 이들이 세포 내에서 발현되면 염색체의 특정 부위를 절단하게 되고, 이렇게 절단된 유전자는 세포 내의 자발적인 기전에 의해 복구되나 그 과정 중에 다양한 돌연변이가 빈번하게 유도되어 그 부분의 기능을 차단시키게 된다(그림 1).
 유전자 녹아웃 마우스의 표현형 분석은 생체 내 유전자의 기능에 대한 이해에 있어서 혁명적인 변화를 일으켰다. 하지만 최근까지도 생쥐의 배아줄기세포(Embryonic Stem cell)가 이러한 유전적 변형에 있어서 필수적이어 그 생산에 많은 시간과 비용이 소요되었다. 바꾸어 말하면, 생쥐 ES cell을 조작하는 대신에 직접적으로 ZFN과 TALEN 단백질을 암호화하는 mRNA를 생쥐의 수정란에 직접 주입하는 방법으로 유전자 녹아웃생쥐를 생산할 수 있는 길이 열린 것으로, ZFN을 사용한 유전자 녹아웃이 이미 생산되어 학계에 보고되었다.
 상대적으로 긴 개발기간으로 인하여 ZFN에 관해서는 그 유전자 적중 효율을 높이는 동시에 독성을 줄이기 위한 집중적이며 광범위한 연구가 진행되어 왔다. 하지만, 아직까지도 어떻게 하면 유전자 적중에 충분한 만큼 특이적인 ZFN을 디자인 할 수 있는지에 대해 의견이 분분한 상태이다. TALEN은 그 암호화 방법이 ZFN에 비해 단순하며, 독성과 적중효율이 높다는 점들이 속속 밝혀지고 있다. 또한, ZFN의 연구를 통해 밝혀진 다양한 장점들을 흡수하면서 놀랄 만큼 빠른 속도로 진화하고 있다. 이러한 배경을 토대로 아직까지 이뤄지지 않은 TALEN을 통한 유전자 적중기술의 개발은 향후 의생명 분야의 발전에 크게 기여하리라 여겨졌다.

II. 본론
 본 연구를 위해서는 두 개의 상이한 전문기술이 필요하였다. 첫 번째로 특정 유전자를 구별하여 마우스의 유전체 상에서 정확히 한 곳만을 인식할 수 있는 TALEN의 제작이다. 이를 위해 두 개의 모델 유전자(Pibf1과 Sepw1)를 특이적으로 인식하여 절단할 수 있는 두 종류의 TALEN을 제작하였고, 이들이 각각 실험관 내에서 높은 효율로 대상 유전자들을 절단하여 돌연변이를 유도할 수 있음을 먼저 밝혔다.
 두 번째는 생쥐에서의 유전자 변형을 위해 필수적인 기술들이다. 이는 분자생물학적인 기술을 통해 TALEN을 메신저(mRNA) 형태로 독성 없이 준비하고, 마우스의 수정란을 자유자재로 다루어 TALEN mRNA의 주입 후에 손상 없이 대리모의 자궁에 착상되어 건강하게 태어날 수 있도록 조작하는 기술이다. 본 연구에서는 두 종류의 유전자에 대한 TALEN을 사용하여 녹아웃 생쥐가 태어나게 하는데 성공하였다. 더욱이, 이렇게 태어난 마우스들을 유전적으로 관리하여 TALEN에 의한 유전자 녹아웃을 검증하였으며, 안정적인 생산이 가능함을 보였다. 생쥐 ES cell의 사용이 배제되었으므로 본 연구에서 녹아웃 생산까지 걸린 시간은 6개월 이하에 불과하였다.
 본 연구결과가 보여주는 놀라운 사실은 TALEN에 의해 생성되는 돌연변이 작용이 단세포 상태인 수정란에서 일어날 수 있다는 것이다. 또한, 유전자의 완전한 차단 없이 특정 아미노산 서열을 바꿈으로써 유전자 상의 특정 부위의 기능을 연구하는데 도움이 될 수 있는 변형된 단백질을 발현하는 유전자변형 생쥐를 생산한 것이다.

III. 결론
  본 연구에서는 두 개의 모델 유전자에 대한 유전자 녹아웃 생쥐의 생산을 TALEN을 이용해 달성하였으며, 이는 TALEN에 의한 유전자 녹아웃 생쥐의 생산이 안정적으로 이뤄질 수 있음을 증명한다. 따라서 앞으로 TALEN을 이용한 유전자 녹아웃이 생쥐의 ES cell의 이용을 상당부분 대체할 것으로 예상되며, 이는 유전자 녹아웃 생쥐의 이용이 필수적이었던 의생명 연구 및 연구개발분야에 큰 의미를 가질 것으로 사료된다.



 ZFN과 TALEN에 의해 매개되는 유전자 적중의 원리. (A) Zinc finger (ZF) motif와 (B) TALE module은 특정 염기서열을 양방향에서 인식할 수 있도록 한 쌍으로 디자인되어 제작된다. 이들은 서로 약간씩 다르게 개발된 비특이적인 FokI endonuclease가 heterodimer를 형성하여야 유전자를 자를 수 있다. 이는 비특이적인 유전자 결합에서 오는 독성을 최소화한다. (C) 이러한 ZFN과 TALEN이 제대로 작동하게 되면 유전자에 DNA 두 가닥 모두를 자르게 된다(double-strand break, DSB). 일반적으로 세포내에서 이러한 유전자 손상은 homologous recombination (HR) 또는 non-homologous end joining (NHEJ)에 의해 복구된다. (D) 만약 이러한 과정 중에 유전자를 바꿀 수 있도록 고안된 donor DNA를 제공해 주면, HR에 의한 유전자 변형을 이룰 수 있다. (E) 이러한 donor DNA가 없다면, 세포는 손상된 DNA 가닥을 단순히 이어 붙이려는 NHEJ 기전을 작동시키며, 이러한 과정은 매우 빈번하게 유전자 상에서 DNA의 결실, 삽입, 또는 다른 염기서열로의 대체가 일어나 유전자의 기능을 제거한다. (BMB Rep. 2012. 45:686-92.)

Journal Reference
Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting
Nat. Biotechnol., 31,23–24(2013) | doi:10.1038/nbt.2477
Young Hoon Sung, In-Jeoung Baek, Duk Hyoung Kim, Jisun Jeon, Jaehoon Lee, Kyunghee Lee, Daewon Jeong, Jin-Soo Kim & Han-Woong Lee

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