지금 현재 메틸렌블루 흡광도 측정법을 이용하여서 황화수소를 측정하려고 합니다. 논문을 읽어보니 zinc acetate 용액: 100ml의 degassed water에 1g을 섞으며, N,N-dimethyl-p-phenylenediamine sulfate용액: 1ml의 7.2mM HCl에 7.4094mg을 섞으면 된다고 하구요. 또 FeCl3 용액: 1ml의 1.2mM HCl에 4.866mg을 섞으면 된다고 합니다.
그래서 실험 protocol은 1. 75ul 샘플 + 250 zinc acetate 용액 + 425ul degassed water를 넣고 2. 133ul의 N,N-dimethyl-p-phenylenediamine sulfate 용액과 FeCl3 133ul를 넣고 3. 10분동안 실온에서 incubate 합니다. 4. 그리고 trichloracetic acid 10%(v/v) 250ul를 넣고 5. 원심분리기 12000rpm에 5분동안 돌려 6. pellet이 형성되면 위에 상층액을 따서 uv 파장(흡광광도계)로 400nm~800nm 를 찍어보라고 합니다.
이렇게 실험을 진행하면 전체적으로 문제가 없는데요. 궁금한게 있습니다... 1ml의 7.2mM HCl같은경우 제가 가지고 있는 시약이 5N HCl을 갖고 있습니다. 그러면 14.4ul의 5N HCl을 1ml의 D.W에 섞으면 제가 구하고 싶은 1ml의 7.2mM HCl이 나오는거 같습니다. 그런데 만약 전체 시약들으 1/5로 줄인다면 200ul의 7.2mM HCl에 1.48188mg N,N-dimethyl-p-phenylenediamine sulfate을 넣으라고 합니다. 이렇게 하는게 맞는지도 궁금하구요. 만약 이렇게 하게되면 0.288ul를 200ul의 D.W에 섞으면 된다는 건데.. 0.288ul가 사실 파이펫으로 따는 것이 불가능합니다.. 그러면 어떻게 해야할까요..? 또한, 1.48188mg을 저울로 사용해서 정량하기가 매우 힘듭니다.. 이또한 어떻게 해야.. 1/5로 나눈 용량들을 구할 수 있을까요??(전체 시약의 모든 것을 1/5로 줄일려고 합니다. 왜냐하면 저희가 현재 사용하는 샘플이 20ul정도 나올거 같거든요. 그래서 샘플 기준으로 모든 용량을 1/5로 줄였습니다.) 좀 도와주세요....
또 sodium sulfide를 200uM, 150uM, 100uM, 50uM 로 희석을해 linear을 확인하려고 합니다.. 어떻게... protocol을 짜야 할까요..???
제가 많이 실험자로서 너무나 부족한 역량을 갖고 있습니다... 배워가는것이 더디지만... 정말 열심히 하려고 합니다.