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[별별소리] 2.4kb DNA PCR 조건질문드려요 !!
감감(비회원)
  (2020-10-27 15:10)
 

한창 배우고 있는 학생인데요 ㅜㅜ 제가 똥손인건지 조건이 잘못된건지 실험 결과가 계속 이상하게 나오네요

V.vulnificus 내 2.4kb 정도 되는 유전자를 PCR하고 있는데 결과가 2.4kb 말고도 그 밑에 잔 밴드들이 4개 정도 계속 뜨네요,, Extension 시간이 잘못된건지 Annealing temperature가 잘못된건지 모르겠습니다 ㅜ 아니면 primer가 specific하지 않은건지,,

Tm값은 F.primer 59.2도 / R. primer 57.3도여서 annealing temperature는 53.2도로 맞췄습니다

Annealing 시간은 40초, Extension은 72도로 2분 30초동안 해서 총 35사이클 돌렸는데 뭐가 문제일까요,,

너무 실험 초반부터 막혀서 답답하네요 ㅠㅠ



태그  #미생물   #PCR   #PCR조건
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  댓글 5  
회원작성글 통닭값올랐다(과기인)  (2020-10-27 16:22)
1
웬만하면 Forward하고 Reverse 프라이머의 Tm 값을 동일하게 디자인하고 했었던 기억이 있네요.
Annealing 및 Extension 조건은 합성이 진행 안되는 조건은 아니라고 보입니다.

해당 PCR product를 Vector에 insertion하는데 쓰는 경우, 젤에 전기영동한 DNA product를 다 gel cutting 과정을 거쳐서 회수했던 기억이 나네요 (그나마 다른 불순물은 버리는 효과도 있으니깐요).

아울러 참고사항으로 위의 gel cutting 과정도 귀찮다고 하면 Gibson cloning 방법도 있습니다.
구글링해보시면 원리하고 Nature method에도 발표됐던 적이 있었던 방법이기도 하니 참고해보셨으면 좋겠습니다. 진심 편했습니다.
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회원작성글 땅콩(과기인)  (2020-10-27 16:50)
2
annealing temperature가 낮으면 밴드가 여러개 나오기는 하던데.......
57도 정도로 해보심은 어떠신지..
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회원작성글 그림(대학원생)  (2020-10-27 23:23)
3
Taq polymerase 쓰시나요? 다른 high-fidelity 쓰시면 요구 anneling온도가 다를 수도있고 hot-start 인지도 확인 해 보시기 바라겠습니다. Annealing 온도를 올리시고 시간도 30초로만 진행 해 보세요. 개인적으로 Q5 polymerase쓰는데, Q5로는 전혀 문제없겠지만.... Taq은 가끔 그런문제가 있더라구요.
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회원작성글 끄적여봅니다(과기인)  (2020-11-02 01:31)
4
priemr test 해본건가요?
SYBR Green 으로 간단하게 ?확인해보면 좋을꺼같아요.
2.4kb 이외의 밴드에 대해 시퀀싱해보면 알 수있을꺼 같아요
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회원작성글 Anoct(대학원생)  (2020-11-03 10:28)
5
꼭 깔끔하게 나와야 하는 거라면 Gradient PCR 혹은 Touchdown PCR 추천드립니다.
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