소리마당 학술
단백질 정제 중 비드만 넣으면 aggregation되는 이유가 뭘까요?
Prot please (비회원)
안녕하세요, 단백질 정제를 시도중인 학생입니다.
his-tagged kinase인데요, inclusion body로 발현이 되어 solubilizing과 refolding을 시도했습니다. refolding까지는 aggregation없이 깔끔하게 진행이 되고, 충분한 농도의 원하는 단백질이 있는것을 immunoblot과 bradford로 확인했습니다. 또한 비드를 넣기 전에 centrifuge로 혹시 있을지 모르는 aggregate를 제거했습니다. Bead를 넣지 않은 상태로는 2~3일 보관해도 aggregation되지 않는 것을 확인했습니다.
하지만 Ni-NTA bead를 넣고 incubation을 시작하면, 20분가량 지난 후부터 aggregation이 시작됩니다. 한시간이 지난 후에는 눈으로 확실히 보이는 수많은 protein aggregate가 떠다니는 것이 확인될 정도입니다. 이후에 column에 loading해 elution을 해 보아도 eluted된 액체에는 단백질이 존재하지 않음을 bradford로 확인했습니다.
incubation 조건은 4 Celcius, 12rpm continuous rotor입니다. Refolding buffer는 2 mM MgCl2, 100 mM KCl, 50 mM Tris, 20% Glycerol, and 10 mM beta-mercaptoethanol으로 구성되어 있으며 pH는 8.0입니다. 정제하고자 하는 단백질은 cysteine residue를 가지고 있고, predicted isoelectric point는 약5.6 입니다.
조언 주시면 정말 감사하겠습니다. 건강하세요.
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