소리마당 학술
Cloning과 Spectinomycin 관련해서 질문 드립니다.
KSOMZD (대학원생)
혹시라도 저희 교수님이 이 글을 보실까 싶습니다만 각설하고.
현재 Spectinomycin이 들어간 vector로 실험을 진행한지 한 달이 다 되어갑니다. 목적은 원하는 insert DNA의 Cloning인데, 생각대로 잘 되지 않아 조언을 구합니다.
제가 사용할 Backbone vector가 든 e.coli를 분양 기관으로부터 받은지가 한 달 전입니다. 50ug/ml* Spectinomycin이 든 LB agar plate에 Streaking 해서 single colony를 딴 다음, 같은 농도의 액체에 overnight해서 culture를 400ul씩 분주해 400ul의 50% glycerol stock과 섞어 -80도씨 보관하고, 동시에 액체에 더 키워서 Miniprep까지 했습니다.
일종의 Control 삼아 Miniprep해서 나온 vector로 E.coli DH5a에 Heat-shock transformation** 했고, 적절한 primer를 짜서 Colony PCR한 결과 몇 개의 Colony에서 Band가 잘 떴습니다. 이들을 또 액체에 키워 Miniprep해서 다시 PCR하니 같은 크기의 Band가 나왔습니다.
같은 방식으로 Miniprep한 vector를 Enzyme cut한 다음, Insert과 함께 넣고 ligation 했습니다. Insert 비율은, 제가 쓰는 vector의 출처 paper가 있기에 그것을 참고했구요. Ligation된 vector로 앞 단락과 똑같이 Transformation을 진행했습니다. 그랬더니 또 비슷한 수의 Colony가 떴는데, 문제는 이렇게 나온 콜로니들을 e-tube에 넣어 다시 액체에 overnight 해보니, 단 하나도 자라지 않았으며, Colony인 상태에서 Cracking gel method를 하건 Colony PCR을 하건 전부 결과가 나오지 않았다(Vector가 들어있지 않았다)는 점입니다.
여기까지 질문은 이렇습니다.
1. Spectinomycin 50ug/ml이 든 LB agar plate에서 왜 False positive들이 잔뜩 나온 것인가?
*100ug/ml에서 Selection을 시도해봤는데, Intact한 vector를 Transformation한 cell도 자라지 않았습니다.
**한 가지 이상한 점은, Transformation method 중에 항생제가 없는 배지에 1시간동안 키우는 step이 있습니다. control삼아 이 step동안 아무 vector도 넣지 않은 cell을 키운 다음, 50ug/ml spectinomycin 고체배지에 깔아봤는데, colony가 20~30개 가량 존재했습니다.
2. Agrobacterium tumefaciens EHA105는 Spectinomycin으로 Selection이 불가능한가?
Agrobacterium을 다뤄본 적이 없지만, 제 나름의 상식적인 판단으로, Backbone에 Spectinomycin resistance gene이 들어있으니 당연히 이것을 Transformation해서 Agrobacterium에 잘 들어갔는지를 판단하려면 같은 항생제를 써야하지 않겠는가 해서, 50, 100, 300, 500ug/ml에 모두 깔아봤습니다만(Spreading 해서) Cell 농도를 다르게 하건 어쩌건 전부 잘 자랍니다.
'키웠다', '깔아봤다' 같은 표현은 모두 overnight(16hr 이상)을 기준으로 합니다.
고견 바랍니다.
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