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[학술] Cloning과 Spectinomycin 관련해서 질문 드립니다.
회원작성글 KSOMZD(대학원생)
  (2020-03-30 11:22)

혹시라도 저희 교수님이 이 글을 보실까 싶습니다만 각설하고.

 

현재 Spectinomycin이 들어간 vector로 실험을 진행한지 한 달이 다 되어갑니다. 목적은 원하는 insert DNA의 Cloning인데, 생각대로 잘 되지 않아 조언을 구합니다.

 

제가 사용할 Backbone vector가 든 e.coli를 분양 기관으로부터 받은지가 한 달 전입니다. 50ug/ml* Spectinomycin이 든 LB agar plate에 Streaking 해서 single colony를 딴 다음, 같은 농도의 액체에 overnight해서 culture를 400ul씩 분주해 400ul의 50% glycerol stock과 섞어 -80도씨 보관하고, 동시에 액체에 더 키워서 Miniprep까지 했습니다. 

일종의 Control 삼아 Miniprep해서 나온 vector로 E.coli DH5a에 Heat-shock transformation** 했고, 적절한 primer를 짜서 Colony PCR한 결과 몇 개의 Colony에서 Band가 잘 떴습니다. 이들을 또 액체에 키워 Miniprep해서 다시 PCR하니 같은 크기의 Band가 나왔습니다.

같은 방식으로 Miniprep한 vector를 Enzyme cut한 다음, Insert과 함께 넣고 ligation 했습니다. Insert 비율은, 제가 쓰는 vector의 출처 paper가 있기에 그것을 참고했구요. Ligation된 vector로 앞 단락과 똑같이 Transformation을 진행했습니다. 그랬더니 또 비슷한 수의 Colony가 떴는데, 문제는 이렇게 나온 콜로니들을 e-tube에 넣어 다시 액체에 overnight 해보니, 단 하나도 자라지 않았으며, Colony인 상태에서 Cracking gel method를 하건 Colony PCR을 하건 전부 결과가 나오지 않았다(Vector가 들어있지 않았다)는 점입니다.

 

여기까지 질문은 이렇습니다.

1. Spectinomycin 50ug/ml이 든 LB agar plate에서 왜 False positive들이 잔뜩 나온 것인가?

*100ug/ml에서 Selection을 시도해봤는데, Intact한 vector를 Transformation한 cell도 자라지 않았습니다.

**한 가지 이상한 점은, Transformation method 중에 항생제가 없는 배지에 1시간동안 키우는 step이 있습니다. control삼아 이 step동안 아무 vector도 넣지 않은 cell을 키운 다음, 50ug/ml spectinomycin 고체배지에 깔아봤는데, colony가 20~30개 가량 존재했습니다. 

 

2. Agrobacterium tumefaciens EHA105는 Spectinomycin으로 Selection이 불가능한가?

Agrobacterium을 다뤄본 적이 없지만, 제 나름의 상식적인 판단으로, Backbone에 Spectinomycin resistance gene이 들어있으니 당연히 이것을 Transformation해서 Agrobacterium에 잘 들어갔는지를 판단하려면 같은 항생제를 써야하지 않겠는가 해서, 50, 100, 300, 500ug/ml에 모두 깔아봤습니다만(Spreading 해서) Cell 농도를 다르게 하건 어쩌건 전부 잘 자랍니다. 

 

'키웠다', '깔아봤다' 같은 표현은 모두 overnight(16hr 이상)을 기준으로 합니다.

 

 

고견 바랍니다.



태그  #분자생물학
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  댓글 5  
회원작성글 강시(과기인)  (2020-03-30 12:58)
1
1. Spectinomycin 50ug/ml이 든 LB agar plate에서 왜 False positive들이 잔뜩 나온 것인가?

*100ug/ml에서 Selection을 시도해봤는데, Intact한 vector를 Transformation한 cell도 자라지 않았습니다.

**한 가지 이상한 점은, Transformation method 중에 항생제가 없는 배지에 1시간동안 키우는 step이 있습니다. control삼아 이 step동안 아무 vector도 넣지 않은 cell을 키운 다음, 50ug/ml spectinomycin 고체배지에 깔아봤는데, colony가 20~30개 가량 존재했습니다.


결국 님의 ㅅ리험에는 control이 없어서 디스커션이 불가합니다.
miniprep해서 얻은 plasmid는 PCR 하기 전에 gel에 걸어서 plasmid를 눈으로 확인하세요.
plasmid map이 맞은지 몇가지 제한효소로 처리해서 gel에서 확인하세요.
PCR은 편하기는 해도 가짜가 많습니다.


control삼아 이 step동안 아무 vector도 넣지 않은 cell을 키운 다음, 50ug/ml spectinomycin 고체배지에 깔아봤는데, colony가 20~30개 가량 존재했습니다. """""""""""

Cell을 키운다음 항생제 없이 키웠더니 자랐다?
이는 스펙티노마이신에 내성을 가진 세균이 오염됬다는 의미입니다. 세균이 오ㅇ염됬을 수도 있지만 배지가 오염됬을 수도 있습니다.
이를 한 번에 확인할 수 있는 클로닝 방법을 사용해야하며 competent cell을 항생제 배지에 깔아서 자라는지 확인이 되었으니 지금 사용중인 대장균을 버리고 오염되지 않은 대장균을 새로 확보해서 실험하세요.

이상이 질문1에 대한 충분한 답이 될겁니다.
질문2에 대한 답은 제가 아그로박테리움에 대해서 알지 못하므로 패쑤
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회원작성글 KSOMZD(대학원생)  (2020-03-30 13:14)
2
Plasmid는 세 가지의 서로 다른 제한효소(HindIII, NheI, EcoRI)를 사용해서 일치하는 크기의 DNA Band가 뜨는 것을 확인했습니다. Plasmid에 Ligation하기 위해 Enzyme cut 한 뒤에 Gel purification을 하게 되는데, 이 때도 Linear한 plasmid(즉, 크기와 일치하는 band)가 뜨는 것을 확인했습니다. 그냥 Plasmid를 젤 내리면 다른 크기의 밴드가 2개 뜨지 않나요?

글에 적지 못했는데, 그냥 Competent cell을 배지에 키우면 안 자랍니다. 이건 당연히 해봤는데, Competent cell을 그냥 Transformation 하듯이 step을 거치되 DNA(즉 Vector)만 안 넣어주면 (즉 1시간정도 액체에 키운 상태면) overnight한 다음날 콜로니가 떠 있습니다.

cell이 오염됐다는 가정은... 글쎄요. Competent cell 준비하면서 DNA가 섞일 일이 없습니다. E.coli가 자발적으로 Spectinomycin에 저항성을 가지기라도 하는 걸까요.
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회원작성글 강시(과기인)  (2020-03-30 16:11)
3
comp cell을 스펙티노마이신에 키우면 안자라는군요.
그러면 comp cell이 오염된 것은 아닙니다.
regeneration 배지(LB나 SOC) 가 오염된 것을 의심해야 하는 상황입니다.
tip, tube, regeneration 배지, spreader 등등을 새로 멸균해서 사용해야 할것 같습니다.

실험실에서 사용하는 E. coli가 자발적인 항생제 내성을 가지는 경우는 없다고 봐야 합니다.
종종 clinical isolate는 항생제 내성이 생기기도 하지만요.

위 오염 문제가 해결되면 클로닝 안되는 문제를 해결해야죠.
클로닝은 다음날 아침 나온 결과를 보고 한 눈에 어느 단계에 문제가 생겼는지 알 수 있더록 실험을 디자인해야 합니다. 그래야 문제가 생긴 단계를 수정해서 결과를 얻을 수 있습니다.
여러개의 control을 디자인해서 해 보세요.
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회원작성글 KSOMZD(대학원생)  (2020-03-30 17:10)
4
그렇군요. Procedure 외적인 기구들에 error가 없는지 한번 생각해 봐야겠습니다. 감사합니다.
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회원작성글 CMC(USP)(과기인)  (2020-04-01 13:50)
5
답변이 달려있기에 빠진 부분만 추가드립니다.

1. 제가 사용할 Backbone vector가 든 e.coli를 분양 기관으로부터 받은지가 한 달 전입니다.
=> 분양 기관에 vector sequence 전달 받을 수 있는지 확인하는게 중요합니다.
특수한 vector가 아닌 경우, 인터넷을 통하여 sequence 확보가 가능할 수 있습니다.

2. 일종의 Control 삼아 Miniprep해서 나온 vector
=> Vector sequence 확보한 경우, sequencing 진행해보세요.
본인이 확보한 plasmid가 원하는 plasmid가 맞는지 확인 필요합니다.

3. Colony PCR한 결과 몇 개의 Colony에서 Band가 잘 떴습니다.
=> ligation product가 아닌 경우, 정상 형태의 vector를 transformation하면 colony 갯수가
셀 수 없을 정도 뜹니다. (plating할 때, 세포 수 조절 (희석) 하면 colony 갯수 조절 가능)
이후 ligation product의 transformation과 비슷한 colony 수를 확인하였다면
mini prep 과정에서 얻은 plasmid가 원하는 plasmid가 아닐 수 있습니다.

4. Spectinomycin 50ug/ml이 든 LB agar plate에서 왜 False positive들이 잔뜩 나온 것인가?
=> 100 ug/ml에서는 colony가 1개도 자라지 않고, 50 ug/mL에서 false positive가 나왔다면
항생제 상태를 의심해보는게 필요할 것 같습니다. 항생제 expiry date 확인하고 stock제조하셨다면
인터넷에서 stock 제조 후 안정성 유지가 얼마나 되는지 확인하시는게 필요할 것 같습니다.
(Research gate에서 항생제 내용 확인하니 25-100 ug/mL 에 큰 차이 없다는 것 같습니다)

5. Competent cell을 그냥 Transformation 하듯이 step을 거치되 DNA(즉 Vector)만 안 넣어주면
(즉 1시간정도 액체에 키운 상태면) overnight한 다음날 콜로니가 떠 있습니다.
=> recovery 단계에 사용하는 배지에 문제가 있을 수 있습니다. (위 답변과 내용 같습니다)

실험이 안되어 trouble shooting을 진행하면, procedure와 reagent 확인도 중요하지만
본인이 실험하고 있는 raw material의 검증을 먼저 진행하는게 필요합니다.
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