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[별별소리] western blotting에서 three-layer probing의 프로토콜이 이해가 잘 되지 않습니다.
회원작성글 학부연구생(대학생)
  (2019-11-11 21:33)

1. Place the membrane in the primary antibody solution and incubate with agitation for 1 h at room temperature or overnight at 4°C.
2. Place the membrane in washing solution and wash three times for 5 min per wash.
3. Place the membrane in the biotinylated secondary antibody solution and incubate with agitation for 1 h at room temperature or 37°C.
4. Place the membrane in washing solution and wash three times for 5 min per wash.
5. Dilute the streptavidin-HRP conjugate (or streptavidin CyDye conjugate if using Amersham ECL Plex detection) in PBS-Tween or TBS-Tween.
6. Incubate the membrane in the solution for 45 to 60 min at room temperature on an orbital shaker.
7. Briefly rinse the membrane with two changes of washing solution.
8. Wash the membrane by suspending it in enough washing solution to cover the membrane and agitate for 5 min at room temperature. Repeat the procedure at least four to six times.
9. Continue with detection as recommended for the selected detection reagent and imaging system.

 

https://cdn.gelifesciences.com/dmm3bwsv3/AssetStream.aspx?mediaformatid=10061&destinationid=10016&assetid=15994

여기서 11. 7.2.2입니다.

왜 3layer 라고 명칭이 붙여진지도 모르겠고

다른 probing 단계와의 차이점을 잘 모르겠습니다...

도와주세요 ㅠㅜ



태그  #western blotting   #probing   #3 layer probing
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  댓글 1  
구글회원 작성글 할라**(비회원)  (2019-11-15 23:14)
1
primary antibody - secondary antibody(biotin-conjugated) - straptavidin(HRP-conjugated) 가 3겹으로 되기 때문에 3 layer 입니다.
아주 흔하게 쓰는 tagging 항체인 HA, Myc 같은 경우에는 곧바로 HRP-conjugated로 사용하는 경우가 있는데 이럴 경우 1 layer가,
그리고 통상적인 primary ab- secondary ab(HRP-conjugated)를 사용하면 2 layer가 되겠네요.
특정 marker를 HRP 반응을 이용해 detection 할 때 Ab를 몇차례 사용하는지로 구분한 듯... 별로 신경쓸 부분은 아닙니다.
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