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 전체 > Molecular Biology-DNA > Southern Blot Analysis
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질문 Southern 도움절실
BB  |  2009.08.22 08:50
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도와주세요.
Southern 이 안됩니다. 3번은 했는데 pasmid DNA 밴드만 보이고, 나머지는 아무것도 안보이네요. 흑..

DNA 는 transgenic plants 에서 추출한거고, sample 이 15개 이고요. genome size 는 2400 Mbp 고요.
 transgenic plants 들은 transformation 한다음에 selection medium 에서 여러달 동안 골라진 calli 들만 regeneration medium 으로 옮겨서 나온 식물들이고요. 참고로 Regeneration medium 에도 selection agent 가 들어 있어서 15개 식물 모두가 transgenic plants 가 아니라서 southern  이 negative 로 나온다는건 좀 아닌거 같고. 제 southern 에 문제가 있는거 같은데 뭔지를 모르겠어요. 도와주셔요. 
 

DNA 추출하고 는 gel 사진 보니 DNA 괜찮은거 같고요.
digest 한 DNA gel  봐도 digestion 도 잘 됐고요.
DNA 문제는 아닌거 같고.

probe 는 DIG random prime kit 로  labeling 했고요 (probe 사이즈는 250bp 정도 됩니다) 
spot blotting 으로 labeling efficiency  확인해 봤는데 labeling 은 문제가 없는거 같습니다.

Membrane 으로 transfer 할때는 10X SSC 로 16시간  정도 했고요.

Pre hyb 랑 hyb 는 42도 에서 했고요. 혹시 온도가 문제일까해서 68도 에서도 한번 해봤고요.
(보통 DNA-DNA 는 42에서 hyb 하는게 무난하다는 소리는 들었고요)

혹시 hyb buffer 가 문제 일까 싶어서.
한번은 formamide 가 들어 있는 버퍼를 써보고. 두번은 formamide 없이 만들어진 버퍼를 써봤어요. 결과는 똑같이 네가티브네요.

Detection 은 CDP-star 로 했고요.
CDP-star 가 나름 센시티브 하다고 들었는데. 그게 아닌걸까요.
아님 제가 어디서 뭘 잘못하고 있는걸까요. 

membrane 을 imager 에 넣고 30분 노출했다 사진보면 
band 라고 하기에는 좀 너무나 빈약한 밴드 비슷한 것들이 좀 보이는 것 같기도 하는데 
정말 밴드라고 하기에는 조금 무리가 있고요. plasmid band 만 선명하고요.
X-ray film 도 써봤는데 x-ray 필름에는 밴드비스무리한 것도 안보이고. 그냥 plasmid band 만 뜨고요.

문제가 뭘까요. 어느과정에서 뭘 어떻게 다시 해봐야 할지 꼭! 알려주세요!







#southern
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리엘피스  |  2009.08.22   
Plasmid (positive control 맞죠?)에서 나왔는데 sample에서 나오지 않았다면 system에는 문제가 없는 듯 합니다.

하지만 감도가 무엇보다 중요한데, 만약 plasmid의 copy수가 sample의 copy수보다 현저히 많다면 감도가 떨어지는 경우에 copy수가 많은 plasmid만 나올 수 있습니다.

이를 우선 확인하는 방법은 plasmid를 serial dilution하여 몇 copy까지 잡아낼 수 있는지 Southern system의 감도를 체크해 보는 것입니다. cDNA probe의 경우에 있어서 10^5 copy정도는 되어야 검출이 가능합니다만 (isotope probe의 경우에), 이보다 낮다면 감도의 문제라고 결론지을 수도 있습니다.

Isotope을 사용하지 못하는 경우엔 DIG과 같은 non-isotopic method가 대체수단으로 사용되고 있지만, 사실 감도가 많이 떨어지는 것은 어쩔 수 없습니다.
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