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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 14063  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 western blotting시 blocking을 안하면 어떻게 될까요?
blocked  | 2009.07.27 18:02
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: 20090720_2146_8.tif (1.50 MB)
blotting을 했는데 멤브레인이 지저분하게 나옵니다. (파일첨부)

blocking buffer는 5% skim milk를 사용했구요.

생각되는 원인으로

1. ab (rabbit polyclonal)가 glycated/glycosylated protein에 붙는 ab인데, skim milk안에 있는
glycated/glycosylated protein에 붙어서 그런게 아닌가 싶습니다.

2. 아니면 protein sample의 loading 양이 적어서 background와 비슷한 속도와 강도로 detection 되어 구분이 안가는 건 아닐까 생각도 듭니다.

첨부사진 왼쪽의, skim milk와 crossreaction이 없는 monoclonal ab와 비교했을때 우선 blocking buffer와의 crossreaction이 결과에 더 영향을 미쳤을 거라 생각되는데요.

다른 blocking buffer 종류들을 찾아 보았으나, ab가 BSA나 casein과도 cross-reaction을 할 가능성이 많아 사용이 꺼려집니다.

protein-free blocking reagent들도 있다고는 들었으나 빨리 결과를 내야해서 시약을 오더해서
실험을 들어가기도 좀 그런 상황인데요.

혹시 blocking을 안하면 background가 더 지져분해 질까요? 아니면 washing 만 잘하면 ab가 memb.에서 잘 떨어져 나갈까요?

고수님들의 빠른답변 부탁드립니다.
#western
 
#blocking
 
#background
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2009.07.27   

항체도 단백질입니다.
blocking안하면 항체도 membrane에 그냥 달라붙습니다.
그래서 membrane전체가 시꺼멓게 시그날을 만듭니다.

blocking인하면 gel에서 protein이 transfer되고 남은 빈 공간에 항체가 붙어버리는걸 방지하기 위해서 BSA나 skim milk로 blocking하는겁니다.

제시하신 사진을 보면 background가 심하게 나타났군요.
이건 blocking이 잘 안되서 그런겁니다.
blocking시간을 늘이시는게 유리합니다.

꽃개구리juno  |  2009.07.27   
일단 blocking buffer 바꿔서 떠 보시죠.
Primary antibody dilution시에는 blocking solution을 쓰시나요?
올챙이Tween  |  2009.07.28   
detergent도 넣었는지...?
꽃개구리juno  |  2009.07.29   
그런데 Tween님 아이디는 Bach를 좋아하셔서 Bach인가요 아니면 Bach1이나 Bach2들 연구하셔서 Bach인가요?
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