1. 네 OD값 확인후 넣으시고 계속 shaking. protocol상에 몇시간 더 하라고 정해져 있을거라 봅니다.
2.차이가 있다면 volume에 따라 다르지만 자라는 속도차와 cell 상태겠지요. 전자가 더 느리게 자랍니다.
3.예를 들면 제가 했던 방법은 플라스크에 일딴 cell을 키우고 원하는 od값이 나오면 그 중 2-3ml정도를 no IPTG로 하고 나머지는 IPTG넣고 shaking합니다.
나중에 정해진 시간이 되면 센돌이 돌려서 pallet이 cell이 되는거고 상층액은 버립니다.
그리고 그 안에 lysis buffer나 준비하신 처리 용액을 넣으시고 그걸 loading buffer와 처리했었는데..
지금 보시면 cell lysis과정을 안적으신듯?하네요. 아님 저것만 본다면 pallet은 섞이지 않은체 로딩하셔야...
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IPTG
(비회원)
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09.07.09 12:40
3번 질문을 조금 추가할게요.
제가 총 3mL 의 LA medium 에 BL21 을 키운 후 OD 값이 맞으면 1mL 을 덜어서 센도리 후 sup 을 버리고 펠렛을 negative control 로 보관하였습니다. 그리고 남은 2mL 에 IPTG 가 1mM 이 되게 넣어준 후 4 hr induction 을 하였습니다. induction 후에 1mL 을 덜어서 센도리 후 sup 을 버리고 이 펠렛을 positive control 로 사용하였고 남은 1mL 은 sonication 한 후 센도리를 돌려 펠렛과 sup 을 따로 보관하였습니다.
즉 샘플이..
1. IPTG 처리하지 않고 그냥 센도리(harvest 한거죠) 돌린 BL21
2. IPTG 처리한 후 센도리 돌린 BL21
3. IPTG 처리 후 sonication 으로 Lysis 하여 얻은 펠렛과 sup
이렇게 4개 인데..
1~3 번 샘플은 1X 로딩 버퍼를 넣고 끓여서 젤에 로딩해야 하는데 끓인 후에 센도리를 한번 돌려준 후 로딩을 해야하는지 아니면 끓인 후에 그냥 로딩을 해야 하는지 햇갈려서요. 그냥 로딩을 할 경우 끓인 후 남아있는 일부 펠렛(데브리스) 도 같이 로딩이 될것 같아서요.
저희가 했던 방법은
IPTG 넣고 안넣고 2 sample을 같이 4시간 incubation했습니다. iptg를 넣고 안넣고이므로
다른 조건은 같아야 하죠. 넣지 않을것을 따로 보관하셨으면 cell양이 동일하다고 보지 못합니다.
그리고 다 끝난 sample은 iptg넣고 안넣고 모두 센돌이 돌리고 펠렛만 남겨서 lysis buffer(아마 이미 protocol에 있을 거라 생각됩니다.)를 넣어주고 sonication하죠. 그리고 다시 센돌이 돌리고 상층액들만 뽑아서 그것들을 SDS-PAGE할 Loading dye와 썪어서 끓여주고 PAGE를 시작하죠.
protocol 점검이 필요하실것 같습니다. IPTG induction은 그것의 유무에 따라 얼마나 원하는 단백질이 발현이 많이 되나 보는것인데... 올리신분께서의 조건들은 IPTG외에도 조건이 차이가 나네요.
혹 다른 목적으로 사용하시는것이라면 제가 올린글은 참고로 해주세요. ^^
아 그리고 여러 자료 참고하실때.
molecular cloning 3권짜리 책 아시죠? 거기에 peptide induction으로 정리되어 있는게 있을 겁니다.
그외 인터넷으로 찾으실거면 peptide induction이나 IPTG induction으로 검색하심 여러 자료 얻을 수 있을 겁니다.
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IPTG
(비회원)
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09.07.09 13:32
답변감사합니다.
프로토콜을 좀 자세히 적진 않았지만 말씀하신 부분은 충분히 고려가 되었습니다.
negative control 의 경우 IPTG 를 치고 있는 4시간의 차이로 cell 수는 다르지만 인덕션에 의한 밴드의 차이만 보면 되므로 별로 중요하지 않다고 하시더라고요.
sonication 부분은 물론 lysis buffer 를 넣고 한 것이고요.
제가 가장 궁금한 부분은..
저희는 negative 콘트롤은 lysis 과정을 거치지 않고 그냥 펠렛을 통채로 끓여서 확인을 하는데..프로토콜을 적으면...
1. OD 가 0.8 되었을 때 1mL 을 덜어서 (IPTG 안넣음) 센도리
2. sup 을 버리고 펠렛에 1X loading 버퍼를 넣고 펠렛을 완전히 서스펜션 시킨 후 10분간 끓임
3. 적당량을 젤에 로딩
이렇게 하는데 펠렛을 끓인 후 로딩할 때 끓이고 바로 로딩을 하면 펠렛의 일부가 젤에 같이 올라가는데 이것이 큰 영향을 주느냐 안주느냐가 궁금합니다.
10분간 끓인 후에 다시 센도리를 돌려주어 insoluble 한 녀석들을 펠렛으로 만들어준 후 상층액만 로딩하는 것이 맞는지 아니면 펠렛(데브리스)이 일부 섞인 채 젤에 로딩되도 상관없는지를 모르겠네요..
최대한 debris없이 상층액으로 사용하심됩니다.
sample buffer 넣고 돌려버리면 incusion body는 확인할 수 없습니다.
발현이 되도 inculusion body가 될 수도 있습니다.
처음 gel을 걸때는 boiling 후 돌리지 마시고 전체를 다 loading하세요.
전체를 다 loading해서 발현이 확인 된 후 원심분리해서 sup과 ppt를 따로 loading해서 induction된 단백질이 soluble한지 확인하는게 순서입니다.