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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 BL21 에서 단백질을 발현시켜 정제할때 궁금점..
단백질정제  | 2009.06.29 14:40
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요. 제가 gene cloning 쪽은 처음 해보는거고 주변에 도움 받을분이 거의 없기에 이렇게 브릭에 질문을 남깁니다.

현재 제가 어떤 cytosolic protein 에 GST (pGEX-6p-1 vector)가 태깅된 플라스미드를 만들어서 BL21 에 트랜스포메이션 까지는 시켰습니다.

이제 IPTG 를 넣어서 단백질을 발현시키고 정제해야하는데 궁금한게 있어서요..

어떤분의 말을 들으니 단백질 정제시 조건(서스펜션시 사용되는 버퍼의 조성 등) 이 그때그때 다르기 때문에 조건을 잘 잡아야 한다고 하는데..제가 발현하려는 단백질과 완전히 매치되는 기존 논문이 없어서 조건을 잡기가 힘든데..버퍼조건이 다르면 결과가 완전히 달라질 수 있는것인지요?

또 인클루젼 바디가 생길 수 있다고도 하셨는데 무슨의미인지를 잘 모르겠습니다. 인솔러블 한것이라고 대충 이해했는데..GST 때문에 단백질이 aggregation 되는것을 말하는 것인지요?
#단백질
 
#정제
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리배불러  |  2009.06.29   
네 버퍼에 따라서 단백질 상태가 달라집니다. detergent의 함유여부, pH, 온도 등에 민감한게 protein이잖아요. 기존 사례를 찾기힘들면 먼저 가장 많이 사용하는 조건으로 해본 뒤에 조절하시는 수밖에 없는거 같네요.
그리고 인쿨루젼 바디란 aggregation된 단백질을 말하구요. 꼭 GST때문이 아니라, 이콜라이에서 단백질의 적절한 folding을 도와주는 샤페론이라는 녀석들이 있는데, 우리가 보통 단백질을 발현시키는 조건에서는 그 단백질들이 엄청나게 빠르게, 많이 만들어지므로 (over-expression이라고 하죠) folding을 도와줄 샤페론들이 부족하거나, translation되는 속도가 너무 빨라서 단백질들이 정신을 못차리고 제대로 폴딩이 안되어 인클루전 바디를 형성할 수 있습니다. 이렇게되면 insoluble해져서 쓸모없게 되버리구요. 그래서 발현시키는 온도를 낮추거나 IPTG농도를 낮추면서 인덕션 시간을 늘리는 방법이 있고, 아예 막 발현시켜서 urea나 guanidine cloride로 denature시켰다가 다시 folding시켜서 회복시키는 방법도 있습니다. 근데 또 잘되는건 37도씨에서도 되게 잘되구요. 사례가 없으시다니, 운좋으면 한방에, 아니면 여러 조건들에서 실험을 해보셔야겠네요. 보통 저는 soluble하게 발현이 안되면, 온도와 inducer를 조절하구요. 최후의 방법으로 urea등을 사용합니다. 다양한 조건이 필요할땐 작은 tube에서 mini scale로 다양한 조건에서 해본 후 scale-up하는 것도 한 방법입니다.
대왕개구리엘피스  |  2009.06.29   

대부분의 GST fusion 단백질들은 같은 조건에서도 수율이나 정제도의 큰 차이없이 정제가 가능합니다. 따라서 정제방법은 일반적인 표준방법을 사용하시면 되지만, 문제는 발현율과 solubility입니다. GST는 많은 사람들이 알고 있고 또한 믿고 있는 것만큼의 solubility를 가지고 있지 않습니다. 따라서 가장 중요한 것은 soluble하세 단배질을 발현하는 조건을 세팅하는 것이며 정제는 resin에 따라 나오는 매뉴얼에 있는 방식만으로도 쉽게 할 수 있습니다. 

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