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질문 ELISA 실험할때 blocking 알려주세요
aldus621  | 2009.06.08 22:56
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

elisa 실험할때 코팅한 후에 blocking을 한다고 하는데
blocking이 뭔지 자세히 설명해주세요.
blocking을 하면 결과가 더 잘나오게 되는건가요??

그리고 blocking buffer 만드는 것도 알려주세요

#elisa
 
#blocking
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리Baltimore  |  2009.06.08   
실험실 마다 틀리겠지만...

우선 블라킹이란 non specific을 줄여주기 위해서 사용하는 것입니다

비슷한 곳에 가서 붙는 항체가 있기 때문에 블라킹을 통해서 specific하게 항원 항체 반응을 유도 하기 위함입니다

따라서 background를 줄여주며 항원 항체 반응을 좀더 특이적으로 일어나게 하기 위해서 사용하는 것입니다

블라킹 버퍼는 기본적으로 BSA가 첨가된 버퍼를 사용합니다


5microgram/well로 사용하며 PBST에 만듭니다 농도는 제가 사용하는 농도이며 랩마다 다를수 있음을 알려드립니다
꽃개구리TX  |  2009.06.08   

microplate는 플라스틱 표면 (정확히는 polystyrene)이 hydrophobic한 성질이 있기 때문에, ELISA에 사용되는 antibody와 hydrophobic (non-specific) 결합을 할수 있습니다.
따라서 이런 결합을 막기위해, antigen coating후에 노출된 플라스틱 표면은 BSA나 skim milk 또는 detergent 등으로 blocking해야 합니다. 또한 antibody 용액에도 BSA나 skim milk를 넣고 쓰기도 합니다.

참고로 BSA와 nonspecific interaction하는 아미노산 서열도 알려져 있습니다.
가령 FHEFWPT 또는 FHENWPS 와 같은 서열은  BSA에도 붙을수 있다고 알려져 있습니다...

aldus621  |  2009.06.09    

그럼 blocking 은 코팅후에 하게 되는 건가요?

실험 진행 순서나 방법도 알려주세요.

보통의 ELISA 방법에 blocking만 넣으면 되는건지 아니면 다르게 해야하는지 잘 모르겠어요~

알려주세요!
꽃개구리Baltimore  |  2009.06.09   

네 맞습니다

코팅후 블라킹입니다 30분에서 1시간 정도 해주시면 되고

저는 보통 1시간 합니다

그다음 PBST 워시 한번하고

antigen binding 합니다

5% BSA로 PBST에 잘 녹이면 됩니다 PBST는 0.05% Tween 20입니다

모든 reaction은 100ul기준 입니다 또한 블라킹 이후 모든 버퍼는 PBST입니다

전 늘 그렇게 했구요 샘플에 따라 변동은 있었습니다

개구리ryan  |  2009.06.09   
 ELISA시 blocking이나 sample등에서 사용되는 buffer의 종류나 reaction volume이 정해져 있는 것은 아닙니다.
 실험에  signal에 따라 유연하게 변화시킬수 있습니다.
 
 예를 들어 blocking시 bsa, casein, milk, serume등 다양하게 쓰일수 있고, 거기에 detergent의 적당량을 섞어주기도 합니다. 비율이나, blocking시간, volume등을 적절히 조절하여 최상의 blocking조건을 찾는 것입니다.

 제가 이 말을 드린것은,
 실험의 원리만 확실히 숙지하고 계시면, 다른 여러가지 조건들은 변화를 시켜도 무방하다는 점을 강조하고 싶었습니다^^;;
aldus621  |  2009.06.09    

알려주셔서 감사합니다.

알려주신대로 실험해 볼께요~
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