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A upstream은 template DNA에 있는 부분인가요?
그리고 target size가 얼마나 되나요?
50mer primer가 annealing temp.가 50도 밖에 안나오나요? 엄청 높을 것 같은데..
Q. annealing 온도를 50도 이하로 해도 되나요??그리고 69도 이상으로 해도 될까요??
(대게 정석으로는 50~65도로 알고 있습니다.)
=> 정석?? 무엇을 기준으로 정석이라고 하시는 지는 모르겠지만 annealing temp.는 primer의
Tm을 보고 결정하는 온도 입니다.
정석이라기 보다는 각 primer에 따라 결정되는 온도이며 annealing temp.가 낮아지면
primer가 짧은 시간에 temp. DNA에 결합이 가능하며 높은 온도에서는 그 반대입니다.
69도 이상의 온도는 annealing + Pol.반응이 동시에 일어납니다.
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초보석사생~;;;
(비회원)
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09.05.13 09:37
A upstream은 template DNA에 있는 부분인가요?
=> 아니요, upstream 부분과 downstream 부부은 template DNA에 있는 부분이 아닙니다.
나중에 PCR로 B 부분을 증폭하게 되었을 때, B부분에 upstream과 downstream부분이 양쪽에 붙는 형태가 됩니다. ( A upstream - B gene - A downstream )
primer에서 template DNA에 처음 직접 붙는 부분은 B쪽이 되겠구요 증폭이 되면서 A 부분도 붙게 되죠.
그리고 target size가 얼마나 되나요?
=> target size라는 말은 template DNA를 말씀하시는 거라면, 996base 정도 됩니다.
50mer primer가 annealing temp.가 50도 밖에 안나오나요? 엄청 높을 것 같은데..
=> 네. 전체적으로 보았을때는 74, 78 이렇게입니다만, template에 붙는 부분이 B부분이므로 이쪽 온도가 55도 입니다.
그래서 -5하여 50도로 한 것입니다.
제가 알고 싶은 것은 혼합 primer를 이용하여 PCR 할때 어떻게 온도를 잡아야하는지 모르겠습니다. ㅠ ㅁ ㅠ
이런 경우에는 Cycle program을 2개로 나누어 하시면 됩니다.
첫번째 PCR은 template에 있는 부분에 primer가 binding합니다.
하지만 PCR product가 어느정도 생기게 되면 product에는 primer전체 부분이 포함되어 있습니다.
따라서 50bp모두 붙는 annealing temp.로 바꿔줘야 합니다.
5cycle은 53도에서 annealing, 그 후 25~30cycle은 63도에서 annealing하면 될 것 같습니다.
그럼,
94도 5분 - 1cycle
94도 1분 - 5cycle
53도 1분
72도 1분
94도 1분 - 25cycle
63도 1분
72도 1분
72도 10분 - 1cycle
=> 93도 3분 1cyc
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93도 30초
53도 30초
72도 1분
5cycs
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93도 30초
63도 1분
72도 1분
30cycs
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72도 5분
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초보석사생~;;;
(비회원)
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09.05.13 20:20
감사합니다~
결과는 안나왔어욤.ㅠㅁ ㅠ;;;
그래도 감사합니다.
아무것도 안나왔습니까?
전기영동 사진을 한번 봤으면 좋겠는데..
그리고 primer 서열도 한번 알려주세요..
안될리가 없는 실험인데..