실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Southern Blot
probe labeling이 잘 안됩니다
레벨1 궁금합니다
southern blot을 하려고 합니다. 600-800 bp 정도 길이로 probe를 디자인하고 rediprime ll를 이용하여 labeling한 후 (32P-dCTP) G-25 sephadex로 purification하였습니다. 그리고나서 radioactivity를 확인해보면 대부분의 signal은 column에서 잡히고 eluted DNA에서의 signal이 너무 약해서 hybridization에 사용하지 못하고 있습니다. column에서의 signal이 원하는 만큼 잡히는 것으로 보아 radioisotope에는 문제가 없는것으로 보이며, 문제는 이것이 probe에 잘 incorporation이 안되서 그런 것 같습니다. incorporation 효율을 높일 수 있는 방법이 있는지 궁금합니다. probe는 PCR한 후 extraction한 것을 사용하였는데요, 일부를 gel에 걸어 대략적인 농도만 확인하고 사용하였습니다. (marker와 비교한 것이긴 하지만 rediprime ll protocol에 나온 필요한 DNA양(2.5-25ng)보다는 충분히 높다고 생각됩니다) DNA가 너무 많아서 incorporation 효율이 떨어진 것인지요? 아니면 상온에서 10분정도 incubation하는데 이 reaction time이 너무 짧았던 것인지요? 아니면 column이 오래되서 purification이 잘 안되었을 수도 있는 걸까요?
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