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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blocking buffer 종류와 차이점?
알실험초보  | 2009.04.30 16:29

1. Skim Milk의 경우, blocking 효과는 뛰어나나, 일부 antibody의 antigen과의 recognition site를 masking하여, antibody의 antigen 인식을 방해하여, band의 specificity를 떨어뜨리는 경우가 더러 발생하고 특히 Phospho form specific antibody의 경우 이러한 일이 발생된다고 알고있는데, 왜 그런것인지 궁금하고,Skim Milk의 어떤 성분이 Phospho form specific antibody에 어떻게 영향을 주는지 궁금합니다.
2. BSA의 경우, skim milk에 비해 blocking효과는 떨어지나, 반대로 skim milk에서 나타나는 문제는 나타나지 않습니다.
이것또한 왜그런것인지?

3. 이것이외의 Skim Milk와 BSA blocking 시 차이점?

4. 이것이외의 다른 blocking  buffer 가 있나요?

5. anti-his Ab  western 할때, 꼭 BSA blocking 을 히야 하는 이유가 Phospho form specific antibody 이기 때문인가요? 아니면 다른 이유가 있을까요?

궁금해요~~~ ㅜ.ㅜ 모르는게 너무 많아요~

#BSA blocking
 
#Skim Milk
 
#anti-his
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리미맹  |  2009.05.01   
1. blocking agent로 주로 사용하는 skim milk나 BSA 모두 blot되지 않은 membrane 표면에 단백질을 코팅하여 1st Ab나 2nd Ab가 non-specific binding을 못하게 하기 위해서인데요..
궁금하신 점은 Skim milk가 어떤 성분으로 구성되어 있는지 확인해 보시면 됩니다. skim milk에는 casein이라는 단백질이 들어있습니다. 이 casein은 phosphorylation된 형태로 존재하기 때문에 Phospho form specific antibody가 binding 할 가능성이 많습니다.
또한 skim milk에는 단백질 뿐만 아니라 여러종류의 carbohydrate가 들어있기 때문에 이들이 일부 antibody의 antigen과의 recognition site를 masking할 가능성이 있습니다.

2. BSA 소의 serum 단백질인데 Skim milk에 비해서 비싸고 거의 단일성분 이므로 nonspecific binding이 적을 수 있습니다만...실제로는 동물세포 실험에서는 nonspecific binding이 많이 일어난다고 합니다 (저는 전공이 미생물이라 잘 몰라요).

3. 1,2번으로 충분할 듯

4. gelatin을 쓰기도 하고요, commercial 하게 판매되는 제품들로 non animal protein brocking reagent가 있고, 아예 protein이 들어있지 않은 protein-free blocking reagent도 있습니다.
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