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- colony PCR로 최종 confirm은 할 수는 없고 positive한 candidate만 모아서 plasmid를 추출한후 제한효소 처리를 통해 확인해야 합니다.
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레벨1
시진핑핑이
(대학생)
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23.06.06 23:30
늦은시간에 답변 감사합니다
Insert fragment가 c cell에 transformation돼서 밴드로 나타날 가능성은 없다고 봐도 되는건가요?
DNA fragment는 degradation된다고 알고 있긴한데 불안해서요 pcr이 워낙 sensitive하니까요
ㄴ
Ligation하실 때 어느 정도의 DNA를 사용한지는 알 수없으나 ligation하고 컴셀에 transformation 과정 중에 분명 반응하지 않고 남있는 target DNA가 있습니다. 셀을 어떻게 까실지는 모르지만 이것이 셀과 함께 배지에 깔리게 됩니다. 매우 낮은 농도이지만... 만약 그 target DNA에 binding하는 primer set으로 돌렸다면 배지에 묻어있던 DNA에서 증폭될 수 있습니다. (보통 셀 딸 때 아주 적지만 딸려 올 수 있습니다). 따라서 cycle 수를 낮추어 specific하게 bacteria에서 증폭되었음을 검증합니다. 저 같은 경우에는 26 cycle 이하로 보통 PCR 돌리구요. 약하게 PCR 되는 것들은 보통 나중에 키워서 DNA 뽑아 sequencing해보면 정상적인 clone이아닌 경우가 대부분 이었습니다. colony PCR을 진행하실 때는 위에서 언급된 바와 같이 하나는 vector에 하나는 target insert에 binding하는 Primer와 cell only나 vector only를 같이하여 control로 사용하는 것을 추천드립니다.
참고로 DNA는 생각보다 stable 하다고 생각되는데 하루 overnight으로 있다고 해서 degradation될지는 잘 모르겠네요. 저 같은 경우에는 PCR products를 상온에 몇일 두었는데도 나중에 문제가 없었던 경우도 있습니다만 케이스 바이 케이스 아닐까 합니다.
- colony PCR 결과로 고민할 필요가 없습니다.
- 최종 plasmid를 추출해서 clone을 selection해야 합니다.