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efrd
(비회원)
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23.06.04 00:03
저희 연구실에서도 routine하게 midi-prep을 진행하고 있어서 간단히 말씀드리겠습니다.
1,2 mini-prep 진행 후 남은 LB media가 4도씨 기준 1주일이 넘지 않았다면, 저희는 보통 사용하는 편입니다. 하지만 확실히 오래 된 bacteria일수록 midi-prep 후 yield가 낮더군요. 그래서 2주 정도 된거면 새로 transformation해서 사용하는 걸 추천드립니다.
저희 연구실의 경우 500ul 정도 남겨두고 그걸 200ml LB에 O/N으로 키워서 midi-prep을 진행합니다. (High copy plasmid기준 보통 150-500ug으로 나옵니다.) 말씀하신 대로 진행해도 상관없을 것 같습니다만 양이 많이 필요하면 더 culture해서 사용하여도 됩니다.
3. midi-prep은 kit 설명서대로 진행하시면 됩니다.
1. 해도 됩니다만, 어차피 overnight incubation 시킬 것이기 때문에 되도록이면 colony 이용해서 키우시는 것을 추천드립니다. transformation 이후 colony plate를 냉장보관해두었다가 사용하는 것이 편합니다. 또한 50% glycerol이 포함된 LB media를 만들어 overnight culture와 1:1로 섞은 후 deep freezer에 보관했다가 필요할 때 파이펫 팁으로 찍어 plate에 도말하거나 바로 접종하여 키우는 방법도 있으니 인터넷으로 검색해보세요.
2. 단지 가능한지 묻는 거라면 가능합니다만, 어떠한 문제도 생기지 않는다는 보장은 할 수 없습니다. transformation이 귀찮을 수도 있겠으나 가능하면 정석대로 진행하는 것이 차후 trouble-shooting 해결에도 좋습니다.
3. midiprep에 특별한 방법이 있는 것이 아닙니다. bacteria를 어떻게 키우든 midiprep은 midiprep 입니다.
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레벨3
쿵쿠따리쿵쿠따
(대학원생)
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23.06.04 07:31
두 분 모두 귀한 시간 내어주셔서 감사합니다!
하나만 더 여쭙겠습니다. :)
그럼 midi 진행할 때 LB 일정량에 콜로니 하나 따서 shaking incubator에 overnight으로 키우고 다음 날 midi 진행하는 걸로 알고 있는데, 이 부분을 overnight 말고 24hr로 키워도 상관이 없을까요?!
네 미디프렙을 하고 계시네요. 저는 보통 500mL로 large prep을 사용하고 있는데 그 프로토콜을 첨부합니다. 참고해서 해보시면 될듯 하구요. 보통 저도 overnight해서 키우긴 하는데 제 경험상 24시간까지 키우는건 크게 문제가 안될듯 하네요. 넘 오래 키우게 되면 세포가 죽게 됨으로 결국은 마지막 획득 DNA 량이 줄어들지 않을까 하네요.