,젤사진에는 primer 밴드가 보이지 않네요.

PCR이 안되었으면 primer가 남아 있어야 합니다. 그러니 primer만 gel에 걸어서 조금만 run 시켜서 농도를 확인하세요.

annealing temperature가 맞지 않아서 PCR이 안된것일 수도 있습니다. gradient PCR 을 해 보세요.

1. 우선 DNA 농도 희석은 계산은 아주 잘 하셨지만 복잡한 방법을 택하신것 같습니다.

일단 50ng/ul을 만드시고 이것을 다시 1/5로 희석하셔서 10ng/ul를 만들고, 이것을 다시 1/2로 희석하셔서 5ng/ul를 만드는 식으로 하시면 더욱 편리합니다.

2. Primer-F 1ul + DW 121ul , Primer-R 1ul + DW 129ul로 100pmol/ul로 만드셨다고 하셨는데, 앞에 1ul는 도대체 무슨 뜻인가요? 처음에 primer가 오면 건조된 펠렛 형태로 오고 여기에 업체에서 넣으라는 만큼의 DW를 넣으면 100p가 됩니다. 펠렛을 1ul로 보신건가요?

3. buffer는 2X PCR master mix를 사용했고

구성은 DW 740ul + 10Xreaction buffer 200ul + 10mM dNTPs 40ul + Tag pol (5 units/ul) 20ul을 사용했고

-> 몇 ul의 reaction에 10Xreaction buffer는 몇 ul, 10mM dNTPs는 몇 ul, Primer는 몇 ul, Tag pol (5 units/ul)는 몇 ul, DW 몇 ul를 넣었다고 쓰셔야 읽는 사람이 알 수 있습니다.

그리고 여기에 Primer는 첨가했다는 말이 없어서 의야했습니다.

4. 그리고  primer Tm과 함께 product의 사이즈를 제시하시는 것이 답을 구하기에 좋겠네요. 예를 들면 1.5kb다 이런식으로요. product의 사이즈에 따라 extention time에 변화를 주어야 하기 때문입니다.

5. PCR 조건은 annealing 온도를 몇 도를 하느냐가 가장 중요합니다. 윗분 말씀대로 조건을 잡아보시면 좋겠습니다.