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효소 역가 저하되는 원인을 파악하고 싶습니다
레벨4 솔로몬이꿈 (대학원생)
안녕하세요.
4,6-alpha-gluconotransferase라는 효소 역가 측정 중에 있는 석사생입니다.
항상 지식을 나눠주시는 모든 분들께 감사하며 오늘도 도움을 구하고자 염치 불구하고 질문을 올리게 되었습니다.
1. MC1061 competent cell에 재조합 단백질을 발현시켜서
2. sonication으로 cell lysis진행한 후
3. centri를 돌려서 상등액 부분만(제 target 단백질이 soluble합니다!)
Ni-NTA column으로 정제 및 투석 진행한 후
4. amylose resin으로 정제 후 농축, 투석을 진행하는 과정을 거쳐서 sample을 얻어냈습니다.
최종적으로 효소 역가와 단백질 양을 측정하기 위해 GOPOD assay와 bradford를 진행하는 중에 문제가 발생하여 원인을 찾고 있는 중입니다.
일단 SDS-PAGE를 통해 단백질 발현이 제대로 이루어진 것은 확인한 상태입니다. band를 보면 2번째, 5번째 lane에서 많은 양의 target 단백질이 나온 것을 확인할 수 있었습니다.
하지만 막상 효소 역가를 측정해보니 굉장히 형편없는 결과가 나왔습니다.
이전에 측정한 specific activity는 0.8~0.9U/mg이 나왔는데
이번에는 0.008로 거의 1/100로 매우 낮게 나왔습니다.
SDS를 보면 발현은 잘 된 것 같고 이전이랑 실험도 동일하게 진행하였는데 역가가 낮게 나온 이유를 도무지 알기가 어려워 도움을 얻고자 질문을 하게 되었습니다.
일단 제가 생각하는 원인들을 나열해보겠습니다.
1. 단백질 발현 진행 과정에서 cell의 최적온도에서 overnight으로 cell을 키운 후에 OD값이 1.5에 도달하면 이후 단백질 발현 양으로 높이기 위해 18도에서 overnight을 진행합니다. 이때 다음날 확인해보니 OD값이 3.5 정도가 나왔습니다. 이전에는 동일 조건에서 OD값이 2.0에 가까운 초반대였던 걸 생각하면 cell 상태가 좋아서 단백질이 단순히 많이 생산되었다고 생각할 수도 있겠지만 다른 문제가 있었던 것이 아닌가 생각하게 됩니다.
2. 단백질 folding 과정에서 문제가 생겼다는 생각도 듭니다.
sds-page로는 단백질을 변성시켜서 folding 여부에 상관없이 분자량으로 target 단백질이 있는지 정도만 파악하는 것으로 알고 있어서 단백질 folding이 제대로 이루어지지 않아 제대로 된 활성을 띄지 못하는 것이 아닌가 추측하고 있습니다..
3. 발현도 folding도 잘 되었는데 gopod 측정 과정에서 각 sample을 사용하기 전에 항상 강한 vortexing으로 sample 농도를 일정하게 맞춰주곤 했는데 그때마다 이제 거품이 많이 일어나는 편이었습니다. 이때 발생한 bubble들로 인해 단백질이 변성될 수도 있다고 하는데 저는 현재로써는 이것을 가장 유력하게 보고 있습니다. 실제로 같은 sample로 gopod를 여러번 진행해본 결과 할 때마다 역가가 저하되는 것을 확인할 수 있었습니다.
그런데 또 의문인 것은 물론 volume 차이가 있지만 sonciator로 cell lysis 를 진행할 때에도 거품이 적지 않게 일어났었는데 이전에는 문제가 없었다는 점입니다.
resin 상태, buffer pH, gopod 용액 상태 모두 확인해보았지만 별다른 문제를 발견하지 못했습니다.
조언 부탁드립니다. 감사합니다!
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