green gate cloning 중인데 cloning이 처음입니다 mod c인 cds를 만들던 중 프라이머 Forward에 atg를 안붙이는 실수를 하여 처음부터 다시 프라이머를 짜서 처음부터 다시 짜서 pcr을 시행 하였습니다. 그런데 그전까지는 pcr이 잘 되었는데 atg를 붙이고 나서부터는 pcr이 되지 않습니다. template의 bp는 2370이고 cdna 사용 중입니다.

실수한 프라이머 forward는 AACA GGTCTC A GGCT GAGTCCTGCAATTGCATT

 였고 tm은 60.2도 였고

새로 짠 primer forward는 AACA GGTCTC A GGCT ATGGAGTCCTGCAATTGC

TM은 60.9도 입니다

리버스 프라이머는 AACA GGTCTC A CTGA CCCCCTCTTCTCTCTCC에 

TM은 60.2도 입니다

pcr 조성

template    cdna          1μl

primer(F+R 각 10pm)    1μl

5x HF Bfr                    2μl

polymerase(phusion)     0.1μl

dNTP                         1μl

DW                           5μl

입니다

pcr condition은

98도씨    30s

98도씨     10s

60도씨     30s

72도씨     1m 15s

cycle은 34번입니다.

실수한 프라이머에서는 PCR이 바로 나왔는데 ATG를 다니까 PCR을 계속 했는데 안나오고 T.M도 57~61도까지 0.5도씩 올려가며 다양하게 하였는데도 나오지 않았습니다. EXTENSION TIME을 1분 15초로 한 이유는 실수한 프라이머를 돌렸을 당시 저 시간대로 해서 나왔기 때문입니다.

그리고 밑에 사진에서 왼쪽에서 첫번째가 LADDER이고 두번째부터 5번째 까지가 59도씨에서 PCR6번째부터 마지막까지가 60도씨에서 PCR한 것 입니다.

같은 온도에서 왜 PCR를 여러개 한 이유는 저도 잘 모르겠습니다....... 계속 실수하다보니 멘탈이 터져서 그런거 같네요....