- pcr을 돌리고single band인 경우 puri를 진행해서 하면 된다고 알고 있습니다

: 잘못 알고 있는 것이고 template가 되는 DNA를 사용하여 바로 염기서열을 바로 읽습니다.

- PCR 증폭으로 단편을 얻어 읽는 것이 아니라 primer walking 방법으로 1차로 읽은 후 마지막 서열을 기준으로 primer를 계속 만들어 읽어 나갑니다.

질문이 많이 애매해요. 

amplify 용 과  시퀀싱 용 프라이머를 혼동해 사용하고 계시는 것같은데 명확학 해야지 알려드릴 수 있을 거 같아요.. 

그리고 전체가 3000bp인데 

980F/1592R => 600bp pcr product생성

2531F/ 3000R => 500bp pcr product 생성  

왜 이렇게 amplify 를 하나요?

해당 프라이머는 저렇게 일부만 생성되서 나머지 부분의 시퀀싱은 어려워요.

full seq 을 하려면, 3000bp 밖의 site 에서  프라이머를 제작해서 amplfy 하셔야 전체 3000bp 의 시퀀스를 얻으실 수 있습니다.

그 후 시퀀싱 프라이머 또한  3000bp 밖이지만 amplify   프라이머보다 안쪽으로 짜서 시퀀싱을 하시는데,

3000bp를 한번에 읽기 어려우므로  sanger  sequencing 보증 길이인 600~700 bp 단위로  겹치게 여러개의 시퀀싱 프라이머를 짜서 시퀀싱 의뢰하시고 

나온 결과를 assemble 하여 하나의 염기서열로 만드시면됩니다.

어려우시면 시퀀싱 분석 업체에 의뢰하시는 것도 하나의 방법입니다.

제일 쉬운 방법은 seq.하고자 하는 DNA를 업체에 sequencing을 맏겨 정보를 받아 보면 되지만, 질문자분은 아마 sequecing reactrion까지 해서 업체에 보내려시는게 아닌가 싶네요.

저도 아주 오래 전에 long PCR한 다음에 gel 정제 후 sequecing reaction까지 해서 이를 다시 정제 한 후 업체에 의뢰하고 읽어지면 다시 primer짜는 식으로 읽어 갔거든요.

바로 위분 말씀 참고 하시는게 도움이 될 것으로 생각 됩니다.

시퀀싱용 프라이머를 이용해서 하려고 하는 상황입니다.

그니까 한마디로 전체가 3911이라고 가정을 하면 223F/2109R, 1898F/3974R, 980F/1592R, 2531F/3304R, 2372F/3247R, 3117F/3926R 이렇게 만들어 두신 시퀀싱용 프라이머가 있어서 이용을 하려고 했는데 전체 3911보다 긴 3974R 부분이 나와서 과연 만들어둔 시퀀싱용 프라이머를 믿고 사용을 해도 괜찮은건지

poly A tail을 붙여서 모르는 부분까지 알 수 있는 방법이 있다고 하던데 그것을 이용해야할지 

마지막으로 1번부터 3911번까지를 잘 쪼개서 전용 시퀀싱을 위한 프라이머를 디자인을 해야할지(논문에도 1F부터 진행하는 건 없어서) 의문점이 생긴 것이었습니다. 

사실 amplify에 대한 정확한 것은 잘 모르지만 우선 Ta-Cloning을 위해 제일 처음으로 진행을 해야하는 부분이라고 알고 있기에 도움을 얻고자 질문을 드린 것입니다