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1. 왜 DW에도 band가 나오죠?
2. touch down PCR을 해야할 만큼 band가 잘 안나오나요?
3. forward, revers primer의 TM 값은 각각 몇 도인가요?
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레벨1
권춘배
(대학생)
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23.03.27 15:33
안녕하세요!
1. primer dimer 형성으로 인해 band가 나온것 같습니다. 여러번 새로 DNA를 추출해봐도 결과가 똑같더라구요..
2. 실험동물을 구입한 Jackson사에서 권장하는 PCR condition을 그대로 따랐습니다 (시간은 제가 설정하였습니다)
3. forward=57.4 / reverse=53.4℃ 입니다
1. primer dimer 형성으로 인해 band가 나온것 같습니다. 여러번 새로 DNA를 추출해봐도 결과가 똑같더라구요..
-> DNA 안 넣고 DW만 넣은 PCR에서 band가 나오는데 왜 DNA를 새로 추출하나요? 보통은 DW를 바꿔봐야 하는 것 아닌지....
그리고 primer dimer가 형성된다고 해도 맨 아랫밴드 정도 나오지 않나요?
제가 경험해보지 않아서 잘 모르는것 일수도 있겠지만..
2. 실험동물을 구입한 Jackson사에서 권장하는 PCR condition을 그대로 따랐습니다 (시간은 제가 설정하였습니다)
MT와 WT band 사이즈를 보니 The Jackson laboratory protocol 24678에 있는 동일한 Primer를 쓰신 것 같은데 거기 제시된 band는 깨끗하던데 문제네요....
3. forward=57.4 / reverse=53.4℃ 입니다
제 상식으로는 anealing TM이 너무 높다고 생각되는데 다른 분들의 의견이 궁금하네요...
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레벨1
권춘배
(대학생)
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23.03.27 16:54
아아 네 DW도 멸균된 것으로 바꿔서 썼는데 똑같은 결과가 나왔어요ㅠㅠ
말씀하신대로 Ta가 너무 높은건가 해서 내일 gradient PCR 해볼까 합니다..
PCR이 잘된다면 문제 없지만 그게 아니라면
4개의 primer를 동시에 넣지 말고
MT primer
WT primer
각각 PCR해서 확인해 보시는 방법도 제안드립니다.
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oslove2016@naver.com
(비회원)
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23.03.27 17:38
전기영동 run time은 어떻게되나요??
전압을 줄이고 시간을 늘려보시는게 어떨까요?
밴드가 내려오다가 만 느낌이라...
윗분 말씀처럼 annealing 온도도 조금 높은 편인것같아요