1. chromosome insertion을 확인하셨나요?

lentivirus vector는 자체만으로 integration을 할 수 있는 능력이 없습니다.

허나 vector의 디자인 상 보통은 promoter-gene의 형태는 그대로이기 때문에 transfection을 통하여 transient expression이 가능합니다.

선생님께서 K/O cell line을 만드실 때 이처럼 transient한 expression을 통하여 Cas9, sgRNA 를 발현시킨 것으로 사료됩니다.

Cas9과 sgRNA는 transient하게 발현되어도 genome에 영향을 주어서 영구히 K/O된 cell이 되긴 하였겠지요. 이는 Cas9과 sgRNA의 genome integration과는 무관한 사항입니다.

F.Zhang 팀의 PX459와 같은 expression용 Cas9 vector들이 분명 존재하는데 왜 lentivirus vector를 갖고 transient expression을 하셨는지는 이해가 가질 않네요...

2. 위와 마찬가지로 lentivirus vector는 단순히 transfection만으로 integration이 불가능하고 self replicating episomal vector와 같이 오랜기간 생존할 수 있는 plasmid가 아닙니다.

따라서 transfection 이후 초반에는 selection도 잘 되고 gene 및 GFP가 잘 발현하겠으나 시간이 지날 수록 transgene들이 발현이 떨어질 것이므로 stable cell line을 만들 수 없을 것입니다.

추천드리는 바로는 expression용 vector와 lentivirus vector를 그 용법에 맞게 쓰시고 (LMO법상으로도 viral vector는 LMO입니다)

stable cell line을 만드시려면 lentivirus vector를 packaging vector와 함께 293에 transfection하여 lentivirus particle을 만들어 이를 infection하세요.

답변 정말 감사드립니다.. 많은 도움이 되었습니다 ㅠㅠ

혹시 한가지만 더 여쭈어 보고 싶은데

저희가 pLenti CRISPR ver2 벡터로 electroporation해서 K/O cell line 만들었고, Western  blot으로도 K/O 이 잘 된 것을 확인을 했습니다.

이 세포들은 Puromycin resistant 한데

Cas9 과 Puro가 integration이 되지 않고 tranisent하게 발현되는 것이라면,

이 세포들이 계속 Puromycin 저항성을 갖고 있는데 세포 자체가 계속 Puromycin media에서 culture를 하였기 때문에 Puromycin 저항성을 가지게 된 것이라고 생각하면 될까요?

감사합니다.

대상 셀이 어떤 것이었고 puro는 농도를 얼마를 처리했을까요?

사실 대조군으로는 sgRNA cloning 하지 않은 vector를 electroporation 한 뒤 같은 농도의 puro를 처리한 그룹이 있어야만 확실히 알 수 있겠습니다만

낮은농도로 오래 처리한 경우 낮은농도의 puro에서는 살 수 있는 세포들만 살아남아있을 가능성이 높다고 생각됩니다.

tranient expression인 경우 세포마다 다르지만 평균 puromycin 1ug/ml 근방의 농도로 처리하였을때 2~3일 내로 selection이 완료되었습니다.

HepG2 (hepatocellular carcinoma) 세포를 사용했고, 

Puromycin 1ug/ml 로 3주 정도 처리 하였습니다.

Puromycin 2ug/ml 으로 처리 시, 세포가 굉장히 많이 죽어서 남아있는 세포가 거의 없어

Puromycin 1ug/ml로 농도를 변경하여서 진행을 했었습니다.

(최종 K/O 확인 한 세포들은 1ug/ml로 Puromycin selection 진행 했음)

선생님 말씀을 들어보니

낮은 농도로 3주 정도 처리하면서 세포가 Puromycin resistant 해 진 것일 수도 있다는 생각이 들었습니다..

감사합니다..ㅠㅠ