- PCR이 안된것 같으며 각 효소의 증폭 속도가 어떻게 되나요?

증폭 속도를 어떻게 알 수 있나요?

agilent사의 PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase

NEB사 Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer

사용하였습니다.

PCR 끝난 후 4oC hold ON 시켰는데, PCR tube가 그렇게 차갑지 않앗습니다. 혹시 PCR tube의 문제일 수 있을까요?

아니면 제가 miniprep한 plasmid가 이상할 수 있을까요?

Amp+ 배지에서 키웠는데 밤새 그냥 박테리아가 자라진 않앗을 것 같습니다만...

그래도 모르는 것이니까...

- 둘다 pfu 계열의 효소이기 때문에 20분 정도는 증폭을 해야합니다.

- 20분 증폭으로도 band가 잘 안나오면 mutagenesis 방법이 여러가지 있기 때문에 쉽게되는 방법으로 하는 것도 좋을 듯 합니다.

- 현재는 조건을 바꿔서 진행하는 것이 효율적으로 보입니다.

네, 선생님

조언 감사드립니다.

해보고 잘 나오면, 댓글 올리도록 하겠습니다.

감사합니다.

안녕하세요

제 경험상으로 젤 중요한것이 프라이머 디자인이더라구요. 몇가지 규칙이 있습니다. 제가 첨부한 파일에 자세히 잘 나와있습니다.

Thermo에서 나온 site-directed mutagenesis방법으로 프라이머 디자인하고 PCR실험을 했을 때 거의 한번에 amplication되고 mutation도 잘 되더라구요. 8kb~10kb 정도면 한번에 잘 될꺼라 생각됩니다.

감사합니다.

speed님, 

저희 조건 바꾼 결과가 나와서 올려드립니다.

ladder에 loading dye를 넣어서 다같이 loading star를 넣어서 내리는 것을 감안하면 10Kb 언저리에서 뭔가가 나오는 것 같은데

이게 맞는 것일까요?