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토라
(대학원생)
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23.03.23 01:37
늦은 시간에도 답변 감사드립니다.
확실히 9년 내내 이런적이 없었기 때문에
말씀대로 DNase 오염은 절대 아닐 것 같습니다..
그랬으면 이미 진즉에 여기저기서 난리가 났어야...했을테니까요..;
일단 지금 문제가 되는 벡터의 stock은 2009년에 만들어진 것입니다..
하나의 stock으로 지금 miniprep을 여러차례 한 것 입니다.
(16일 농도 약 240ng/ul 20일 재시도시 220ng/ul 정도,
오늘 Colony로부터 minprep한 애들은 둘 다 110ng/ul 정도..;)
새로 transformation할 때 사용할 예정인 comptetent cell 대략 2020년 혹은 2021년 정도에 만들었습니다...
일단 확실한건..저희가 다른 Enzyme을 주로 쓰는 것이
EcoRI,NotI,,NheI,HindIII,XhoI,XbaI 요정도로 사용하고 있고,
NdeI은 이번에 난생 처음 주문해서 써보는 것입니다...
뭐 어떤 댓글에는 EcoRI이 Star activity가 겁나 잘생긴다..라는 말도 본것 같은데 그런 것치고는 9년동안 저 enzyme들 만큼은 overnight을 해도 그런 일이 없었습니다. 그렇다고해서 NdeI이라고 별반 다를게 없지않을까 생각은 듭니다...;
NdeI이 문제인건지, 아니면 오래된 vector라서 문제인건지..
다른 벡터로도 동일한 문제가 생기는지도 확인해보겠습니다..
저는 제일 의문인 것이 지난 번 질문하실 때 vector sequencing 맏겼는데 primer가 binding되지 않아 실패했다고 하셨는데 어떻게 그 vector라고 확신하고 실험을 진행하시는지 입니다.
너무나 당연히 그러셨겠지만 혹시나 하는 질문인데 해당 antibiotics가 포함된 배지에서 잘 자라는건 맞나요?
그리고 지난번엔 plasmid로 다시 TF하셔 보시겠다고 했는데 그런 내용은 없고 있던 균주 그냥 stracking해서 뜬 콜로니를 키워서 다시 prep했다고 하셨는데 그렇다고 차이가 있을것 같지는 않거든요.
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토라
(대학원생)
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23.03.23 09:38
두분 다 답변감사드립니다.
1. 그 부분도 문제인데...다시 확인해보니 해당 스톡을
만든분이 DH5a인지 BL21인지 기재안했습니다;;;
저희가 단백질뽑으려고 쓰는 벡터인데 아무것도 안넣은애를 BL21에 넣어두실것같진않습니다. 이를 확인할 방법이 있는가요..?;; 찾아보겠습니다.
2. 마찬가지로 해당 벡터에서 miniprep을 한거라...
최근에 다시 transformation은 하지않았습니다.
한번 말씀대로 다시 tranaformation하고 진행해보겠습니다.
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3. 일단 sequencing 맡길때 T7 promoter와 terminator를 썼는데 두 프라이머 사이에 250bp정도 차이가 있습니다. 시퀀싱보냈던거는 버리고 다시 프렙한것이긴 합니다. 전부 다 암피실린 배지에 너무나도 잘자랍니다..(암피실린도 새로 다 녹였습니다) ㅜㅠ 배지 내에 엉뚱한게 떠다니거나 스핀다운시키면 이상한 색을 띄거나 그런게 전혀 없습니다.
4. transformation은 오늘 오후 진행할 예정입니다.
다른 실험도 있다보니;; 밀리고있습니다ㅜㅠ
새로 프렙한 벡터, 예전에 남은 벡터 모두 시도해볼 예정입니다.
다른 제안도 하나 드려볼게요.
그냥 제 의견입니다.
pET-21a(+)에 Nde 1말고 다른 enzyme site들이 많잖아요.
실험실에 있는 제한효소 중에 거리가 좀 있어서 double digestion하면
gel 상에서 둘 중 작은 사이즈 구분할 정도의 거리에 있는
두개를 선택하셔서 잘라보시는건 어떨까요.
multi cloning site에서 하나 다른 곳에서 하나 하시는게 좋을거구요.
전 어디서 vector 분양받으면 그렇게해서 일단 맞는지 확인하거든요.
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토라
(대학원생)
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23.03.23 12:03
어우; 그럼 다른 삽질하지말고
바로 DH5a로 집어 넣겠습니다....
시험조아님 말씀처럼 test용으로는 다른 enzyme을 쓰는건 고려할수있는데 저희가 pET21a를 고른 가장 큰 이유는 다른 bacterial expression용 벡터가 몇가지 없습니다.. ㅠ pRK172는 워낙 옛날거라 맵에 대한 정보가 찾기가 어렵고... 저희가 지금 뽑으려는게 아무 tagging이 안붙어있는 tau단백질인데...
지금 addgene에서 주문하기에는 시간이 너무 걸리고
c-terminal tag는 집어넣을 단백질에 stop codon이 있으니까 만들어지지않겠지만 다른 벡터들은 N-terminal에 GST나 Flag, His가 달려있는데 마땅히 그 부분을 한가지 enzyme만으로 잘라내기가 어려운 문제점이 있었습니다.
하지만 pET21a는 앞쪽이 T7 tag 달려있긴한데 NdeI으로 잘라서 MCS까지 통째로 잘라낼 수 있기 때문에 선택했습니다.ㅠ
벡터맵을 다시 봐야알겠지만...자를수있는게 있다면 해보겠습니다.
- 어우; 그럼 다른 삽질하지말고
바로 DH5a로 집어 넣겠습니다....
: 답변하는 사람은 자기 실험처럼 신경 쓰면서 최대한 빠르고 정확한 해결 방법을 찾고자 고민을 하며 해결책을 제시하는데 상당히 실망스러운 답변이네요.
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토라
(대학원생)
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23.03.23 12:34
제가 균주에 대한 지식은 전무했던탓에 벌어진 일이기도 합니다. 답글들을 보고 새로 transformation하는 것외에는 큰 선택지가 없는것 같아서 황급히 댓글 달았습니다. 실망 안겨드렸다면 죄송합니다.
실은 어젯밤중에 일단 NdeI으로 one cut한 애들 중
밴드가 남아있던 애들은 XhoI으로 2시간 cut하고
gel purification 하려고 촬영했을 때 잡밴드없이 5kb에서 깔끔히 있어서 그걸 gel purification해둔 상황입니다.
일단 그래서 오늘 당초 계획은
1. 기존 과거부터 남아있던 vector
2. 어제 잘라서 정제해둔 product. (제대로 잘린건지 확인차)
3. 2랑 pcr product ligation 시킨것.
세가지 다 transformation 진행할 계획입니다.
벡터 상태가 멀쩡한게 아니라면
2,3 둘 다 자랄것이고..(혹은 안자라거나)
멀쩡한게 맞으면 자른것은 실질적으로 80bp정도가
나가 떨어졌으니 3만 자랄것같습니다..
cloning과 1로 새 stock과 plasmid 만드는것 전부
동시에 진행해봐야할것같습니다
학위과정중엔 원래 삽질 많이 하잖아요...ㅎ
지금도 그렇지만 저도 많이 부족해서 진땀 꾀나 뺐었구요.
그래도 동분서주 의견 듣고 시도해 보시는 모습이 이쁘십니다.
건승하세요~
그리고 제가 아까 말씀드린건 vector를 바꾸라거나 cloning 용으로 자를 때 제한효소를 바꾸라는 말이 아니었구요.
그 벡터가 맞는지 사이즈 확인 차 잘라 보시라는 뜻이었어요.
Nde 1 은 효소문제가 아닐지라도 자르면 맨날 없어진다시기에 괜히 찜찜하니까 제외해보시라고 한 거구요.
무튼 다시 TF해서 해결되면 안해봐도 되는 문제입니다.
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토라
(대학원생)
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23.03.23 13:21
아유 아닙니다ㅜㅠ
매번 두분 다 답변해주셔서 감사합니다.
일단 Transformation해보고 아무 문제 없으면
다행이긴한데...문제가 생기면 pET21a에 저희 실험실에 보유중인 벡터들중에 MCS외에 자를만한게 있는지 맵을 살펴본 후 확인해보겠습니다.
감사합니다!