실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Pull-down Assays
luciferase assay에 사용할 material 관련 질문 드립니다.
레벨2 크리스12 (대학원생)
안녕하세요. 항상 감사드립니다.
혼자 고군분투하고 있는 석사 수료생입니다..
luciferase assay를 수행해야 하는데,, 논문을 찾아가면서 필요한 material들을 정리해봤습니다.. 다음과 같이 실험하는 게 타당할지 검토해주시고 의견 주신다면 정말 큰 도움이 될 것 같습니다.
NF-κB가 특정 유전자 (gene X라고 하겠습니다) 의 프로모터에 결합해서 transcription을 조절한다는 가설로 실험을 진행하려고 합니다.
이를 위해 다음 세 종류의 플라스미드를 HEK293T cell에 transfection할 계획입니다.
(1) geneX의 프로모터 (putative NF-κB binding site 포함)와 luciferase encoding region가 포함된 pGL3 basic vector
→ 직접 클로닝해서 얻을 예정
(2) NF-κB의 subunit 중 하나인 'p50'을 과발현시키기 위한 p50 expression vector
→ addgene에서 판매하는 'p50 cFlag pcDNA3' 구매 예정
→ https://www.addgene.org/20018/
(3) NF-κB의 또 다른 subunit인 'RelA'를 과발현시키기 위한 RelA expression vector
→ addgene에서 판매하는 'RelA cFlag pcDNA3' 구매 예정
→ https://www.addgene.org/20012/
대조군을 위해 (1) 대신 putative NF-κB binding motif에 mutation을 도입한 vector도 제작할 예정입니다.
Transfection은 lipofectamine2000을 사용해서 3종류의 plasmid를 동시에 transfection할 계획입니다.
저의 디자인과 수행 방식이 타당한가요?
연구실에 자세히 물어볼 선배가 없어서 도움이 절실합니다..
Flag로 tag된 p50, RelA를 발현하는 벡터를 luciferase assay에서 해당 protein들의 과발현용으로 사용하는 것이 적절한지 확신이 서지 않습니다..
DNA binding effect에 영향을 주진 않을지.. 또 p50과 RelA는 heterodimer를 이루어서 작용하는데, flag가 둘의 결합에는 영향을 주지 않는지..
HEK293T monolayer에 세 종류의 plasmid를 동시에 transfection할 때 각각의 세포 안에 세 종류의 plasmid가 전부 들어가야 하는 건데.. 이걸 어떻게 확신할 수 있는지.. 실험에 대한 확신이 부족합니다..
고견 나누어주시면 반영해서 실험 잘 해보겠습니다.
미리 감사드립니다!!
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