실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
qPCR용 primer test중인데 negative에서 band가 보입니다
레벨1 퉤퉤 (대학원생)
안녕하세요.
qPCR을 하기위해서 primer를 제작을 했습니다.
target gene은 vector에 있는 GUS유전자를 target으로 primer를 제작했습니다.
target size는 219bp입니다.
실험 내용은 vector를 식물체에 형질전환을 했고, 형질전환 된 식물체에서의 GUS를 정량하는 것이 목표입니다.
정량 이전에 첫번째 밴드는 gDNA에서 qPCR용 primer로 증폭을 한 것입니다.
mutant를 target으로 한 primer이기에 gDNA에서는 증폭이 되면 안되는데 자꾸만 밴드가 뜹니다 ㅠ
Tm값은 61도이고, AT는 56도로 PCR을 진행했습니다.
혹시 AT값이 낮아서 non-specific한 밴드가 나오는건가 싶어서 PCR 진행시 55~60도로 gredient를 주어도 모든 AT온도에서 밴드가 나옵니다 ㅠㅠ
두번째 밴드는 공벡터 즉, GUS를 가지고 있는 벡터(형질전환에 사용된 벡터)에 증폭을 시킨 것인데, 사이즈는 맞는 것 같습니다. 그런데 10kb 이상으로 밴드가 희미하게 더 뜹니다.
사이즈가 커서 벡터가 나온건가 싶습니다..
(벡터농도가 27ng/ul였는데 급해서 희석을 안하고 1ul따서 PCR을 진행했는데 그것 때문일까요 ?)
도움을 주십시오 ㅜㅜㅜ
Bio마켓 프리미엄