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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 cDNA 합성 전 rna 농도
개구리oneday(대학원생)  | 02.02 02:01
제가 RT-PCR을 하려고 RNA을 뽑았습니다.

6-well에 6*10^5 cell/ml 로 시딩하고 처리하고 RNA를 뽑는 과정에 pallet이 매우 적어서 걱정을 했습니다.

cDNA 합성전에 RNA 농도를 측정하였는데

전에 동일한 조건으로 뽑았는데 400~600ng/ml 대로 나왔습니다.

그리고 cDNA 합성할때 농도를 1ml에 맞춰서 계산합니다.



근데 이번에 RNA 농도가 none이 77이 나오고 처리한 것들도 300ng/ml가 나왔습니다. 머가 문제일까요?....

cDNA 합성할때
DEPC DW : 20 -1-0.3 -계산농도
RNA : 계산농도 Oligo : 1ul hexamer : 0.3ul = total 20ul
이렇게 하는데 계산을 해보니 none은 13ul를 넣어야하더라고요....

이렇게 해도되나요?... 아니면 다시 처음부터 해야되나요ㅜㅜ


#RNA extraction
 
#rna 농도
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  02.02 09:01  

- 현재처럼 들쭉날쭉한 수율이면 추출 전 cell 수 관리를 해서 기준점을 잡아 보세요.

 

- 77ng/ml, 300ng/ml이면 현재 RNA는 폐기하고 다시 추출하는 것이 좋을 듯 합니다.

개구리oneday  |  02.02 10:50  

rna extraction 하기전까지 cell 확인했을때 cell 수가 동일하였는데

rna Pallet을 75% etoh로 washing하고 버릴때 pallet이 좀 떨어져 나간 것 같습니다 ㅜㅜ

cDNA합성할때 oligo, hexamer를 제외하면 18.7ul 이하로만 넣으면 되는 것같은데... 그래도 다시 rna 뽑는게 좋을까요?

대왕개구리SPEED  |  02.02 12:06  

- RNA를 몇 ug 사용할 건가요?

 

- 양이 적게 나온경우 전기영동 해보면 대부분 분해된 경우가 많아서 경험상 다시 뽑는 것이 좋을 것으로 얘기했습니다.

개구리oneday  |  02.02 12:18  

저는 RNA를 cDNA로 합성 후 rt-pcr을 할 예정입니다!

 

대왕개구리SPEED  |  02.02 12:28  

- 네.. 당연히 RT용으로 알고 있습니다.

 

- RT용이면 더욱더 RNA quality가 중요합니다.

 

- RNA 얼마를 사용할 예정인가요?

개구리oneday  |  02.02 12:34  

얼마나 사용할지는 잘 모르겠습니다....

지금 현재 계획은 지금 뽑은 rna 로 한번만 cDNA 합성하고 보고자하는 프라이머 결과를 보고 이거에 대한 연구를 더 자세히 할지 말지 결정할 예정입니다.

대왕개구리SPEED  |  02.02 12:48  

- 사용량이 정해져 있지 않는데 시료를 폐기 할지 사용 가능할지 판단이 가능한가요?

 

- 일반적인 경우 1ug ~ 2ug/reaction, skill 수준이 높은 경우 100ng/reaction으로 합니다.

 

- none이 77이 나오고 처리한 것들도 300ng/ml가 나왔습니다

현재 시료를 최소 농도로 사용한다면 각각 1.3ml, 333ul가 1tube 반응 당 필요하기 때문에 폐기하고 다시 추출하는 것이 좋다고 한겁니다.

 

 

개구리oneday  |  02.02 13:04  

제가 아직 많이 부족해서 말씀을 이해를 잘 못하고 있는 것 같습니다.ㅜㅜ

protocol를 보니 RNA 농도 측정 후 농도를 1mg에 맞춰 계산한다고 하여 1000ul /concentration ng/ul을 한 후 이 결과로 나온 용량(ul)을 cDNA 합성할때 사용합니다!
 

대왕개구리SPEED  |  02.02 13:06  

- 정확히 현재 추출한 RNA 시료의 농도가 어떻게 되나요?

개구리oneday  |  02.02 14:11  

none : 76.76 ng/ul  , sample 1 : 283. 24 ng/ul , sample 2 : 320. 96 ng/ul

입니다!

대왕개구리SPEED  |  02.02 15:04  

- 질문에는 /ml이라고 나와있습니다만..

 

- 1ug/tube로 계산해서 한번 해보세요.

개구리oneday  |  02.02 16:24  

아 질물에서 ml는 제가 잘 못적었습니다.

농도는 ng/ul 단위가 맞고

RNA sample 농도를 1ug로 계산해야한다고 합니다.

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