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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 PGL3-basic vector에 cloning이 잘안돼요
알닝내임(대학원생)  | 01.25 17:57

vector, insert, t4ligase 등 모두 문제 없는 걸로 확인되었는데요,

cloning 후 확인을 위해 restriction enzyme으로 잘라보면 insert사이즈의 밴드가 안나와요ㅜㅜ

원스텝으로 진행되는 실험이라는데 몇번을 해도 cloning이 안됩니다. 어떤 부분에서 문제가 생긴걸까요?

#cloning
 
#pgl3 vector
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.25 22:35  
V, I, ligase에 문제가 없는지는 어떤 방법으로 확인했나요?
대왕개구리강시  |  01.26 10:25  

모든 실험에는 control이 있어야 분석이 가능합니다.

vector self-ligation 이 되는지?

잘라서 준비한 vector에는 혹시 안잘린 supercoil plasmid가 오염되어 있지 않은지? 

컴셀은 효율이 좋은지 등을 볼 수 있게 control을 함께 하는 버릇을 들이세요.

알닝내임  |  01.26 11:07  

insert는 tavector에 넣은 pcr product를 kpn1과 xhol1로 cutting한 것인데요, insert만 따로 전기영동하여 해당 size와 똑같이 나온것을 확인했습니다. 

그리고 자른 vector는 자르지않은 vector와 전기영동해서 확인했습니다.

그리고 ligase는 이번에 새로 시킨거라 문제 없을겁니다. ㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  01.26 12:03  

- 그리고 ligase는 이번에 새로 시킨거라 문제 없을겁니다. ㅜㅜ

: ligase 활성이 있다고 모든 cloning 실험이 한번에 되는 것은 아닙니다.

 

- vector와 insert는 ligation에 문제가 없이 준비 된 것을 확인해야지 실험에 문제가 없다고 볼수 있습니다.

 

- ligation test를 해서 vector, insert의 ligation 반응에 문제가 없는지 확인해 보세요.

 

- 물론 CP cell도 문제가 없는 것을 확인해야 합니다.

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