안녕하세요, 현재 IHC 컨디션을 잡고있는 대학원생입니다.

고수분들의 의견을 얻고자 질문글을 올립니다.

DAB으로 staining을 하는데,  Background가 너무 심하게 잡히며

특히 처리 하자마자 색이 변할정도로 반응이 너무 빨리일어나기도 하고 Control에서 계속 염색이됩니다...

2차 항체를 1:1000으로 dilution하니 조금 덜하긴 해도 계속해서 염색이됩니다.

Peroxidase Quenching 10분,

Pressure cooker 및 Trilogy로 deparaffinize, antigen retrieval 하였습니다.

Control은 두가지가 있습니다.

그 Control 군에 1차 항체 단계에서 No antibody (PBS), Rabbit IgG 를 사용했고

10% Normal Goat serum blocking,

2차 항체 Goat anti-rabbit 사용하였습니다.

DAB은 Vector laboratory에서 제시한 프로토콜 대로 사용하고 있습니다.

현재 생각해본 개선점으로는

1. Wash buffer로 PBS-0.1% Triton X-100 을 사용중입니다. TritonX-100을 Tween20으로 바꿔보려합니다.

2. DAB을 더 Dilution 해보는 것도 좋을 것 같습니다.

3. Wash 를 더 많이 해보려 합니다.

4. Antigen retrieval 시 Pressure cooker를 사용했는데, 이게 damage를 주었을 수 있을 것 같습니다. Microwave로 바꿔서 시도해보려 합니다.

위 네가지 외에 제가 더 해봐야할 부분이 있을까요?

감사합니다.