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IHC high background 및 control이 염색 됩니다.
레벨1 으딩딩 (대학원생)
안녕하세요, 현재 IHC 컨디션을 잡고있는 대학원생입니다.
고수분들의 의견을 얻고자 질문글을 올립니다.
DAB으로 staining을 하는데, Background가 너무 심하게 잡히며
특히 처리 하자마자 색이 변할정도로 반응이 너무 빨리일어나기도 하고 Control에서 계속 염색이됩니다...
2차 항체를 1:1000으로 dilution하니 조금 덜하긴 해도 계속해서 염색이됩니다.
Peroxidase Quenching 10분,
Pressure cooker 및 Trilogy로 deparaffinize, antigen retrieval 하였습니다.
Control은 두가지가 있습니다.
그 Control 군에 1차 항체 단계에서 No antibody (PBS), Rabbit IgG 를 사용했고
10% Normal Goat serum blocking,
2차 항체 Goat anti-rabbit 사용하였습니다.
DAB은 Vector laboratory에서 제시한 프로토콜 대로 사용하고 있습니다.
현재 생각해본 개선점으로는
1. Wash buffer로 PBS-0.1% Triton X-100 을 사용중입니다. TritonX-100을 Tween20으로 바꿔보려합니다.
2. DAB을 더 Dilution 해보는 것도 좋을 것 같습니다.
3. Wash 를 더 많이 해보려 합니다.
4. Antigen retrieval 시 Pressure cooker를 사용했는데, 이게 damage를 주었을 수 있을 것 같습니다. Microwave로 바꿔서 시도해보려 합니다.
위 네가지 외에 제가 더 해봐야할 부분이 있을까요?
감사합니다.
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