실험 Q&A Chemical biology > Analysis
LDH assay (abcam) 질문입니다.
레벨1 gongbaek (과기인)
HepG2에 약물을 처리해서 Cytotoxicity를 abcam의 LDH assay kit를 이용해서 확인하려고 합니다.
예비 실험으로 Acetaminophen을 20mM농도와 5mM농도로 처리 해봤는데 결과가 이상하게 나오는데 이유를 모르겠어서 질문 남깁니다.
프로토콜은
먼저 WST substrate mix를 1.1ml ddH2O에 녹이고 Assay buffer와 200uL : 10mL 비율로 섞어 LDH reaction mix를 제작하고 농도별로 acetaminophen을 처리 한 세포의 배지를 100uL씩 따서 96well plate에 옮긴 후, 거기에 LDH reaction mix를 100uL씩 넣어 digital rocker에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용해 450nm 파장으로 absorbance를 측정했습니다.
예상한 결과는
acetaminophen 20mM농도로 처리한 cell의 배지에서 가장 높은 OD값이 나오고 아무 처리 하지 않은 cell에서 가장 낮은 OD값이 나오는 것인데
실험 결과는
20mM 농도에서 가장 낮은 0.2의 OD값이 나타났고 5mM가 가장 높은 1.05의 OD 값이 나타났고 Control그룹에서 0.6정도로 중간 값이 나타났습니다.그리고 Background control로 cell 배양에 사용하지 않은 새 배지를 사용했을 때는 1.5의 높은 OD 값이 나타났습니다.
5mM에서 Cell이 많이 죽은것이라면 20mM에서 죽지 않은것으로 나타난것도 의아하고 세포배양에 사용하지 않은 새 배지에서 1.5로 높은 OD 값이 나타난게 이해가 되지 않습니다.
프로토콜의 문제일까요.. kit는 새거라 kit 문제는 아닌 것 같습니다.
고수 분들 도와주세요 ㅠㅠ
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