실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Purification/Isolation
RNA 추출 실패.. 이유가 뭘까요?
레벨1 도핑 (대학생)
안녕하세요 RNA seq을 위해 RNA 추출을 몇 번이나 하고 있는데 전부 RNA가 깨져서 나옵니다. 어떤 스텝에서 잘못되었는지 알수가 없어서 글을 올리게 되었습니다. Trizol 사용한 매뉴얼로 추출 중인데.. 전부 깨져서 band 세개중에 제일 아래에 전부 몰려있습니다
260/280은 1.7, 2.1, 2.0로 나오고 260/230은 1.7, 2.2. 2.2 입니다.
우선, 시료는 몇 달전 샘플링하여 은박지로 싸서 -80도의 deepfreezer에 보관중입니다. 실험 전 실험에 쓰이는 모든 도구들(튜브, 팁통, 시약 스푼, 막자사발, 아이스버킷, 랙, 책상, 피펫 등등)은 RNAzap을 뿌려주었습니다.
샘플 무게는 50-100mg 사이로 맞췄고,
Trizol, Chloroform 넣은 후에는 tapping, inverting으로 섞어주었고,
isopropanol 넣은후에는 천천히 부드럽게 inverting해주었습니다
에탄올 넣은 후 pellet이 잘 안떨어져서 강하게 tapping했는데 그게 깨짐의 원인이 될까 이번에는 안떨어져도 그냥 centri돌렸는데... 이거나 저거나 결과는 안좋네요 ㅠㅠ
드라이 할때 pellet건드릴까봐 천천히 말렸는데 오히려 pellet이 건조되어서 한번에 다 빨아들인 후 남은건 짧게 spindown후 10ul tip으로 빨아들이고 건조한후 DEPC 넣었습니다
여러 스텝들 사이사이 RNAsezap은 손에 수시로 뿌려주었어요
의심point들입니다
1. Zap으로 뿌린후, 손이 느려서 좀 오래 방치되었는데(도구들) rnase에 노출되었을까요
2. 에탄올이 덜 흡수가 되어 그런걸까요? 벽면에 진짜 쪼그맣게 있긴 했는데..
이번에는 상층액도 욕심 안부리고 400ul 만 뽑고, pellet 안건드리려고 tapping도 조심스럽게 했는데 결과가 안좋아서 속상하네요. 아님 샘플 자체에 문제가 있는걸까요..
+) 앗 사진이 돌아가있네요 ㅠㅠ 제일 밝은게 아래쪽 세번째 band입니다
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