liver에서 kupffer cell을 얻기위해, 

perfusion -> Filter -> 2 gradient percoll -> cell seeding (2h) -> 부착된 kupffer cell 떼어내서 qRT-PCR을 진행하였습니다.   

(SYBR green mix는 thermo꺼 사용하고 있습니다.)

kupffer cell 수가 너무 적어서, trizol이 아니라 qiagen RNeasy mini kit를 이용해서 RNA isolation을 진행하였는데, 이때 59.1ng/ul로 측정되었습니다.

( 260/280은 1.92, 260/230은 0.76으로 나왔었습니다.)

cDNA를 최대한 잘 합성시키고자, RNA를 전부 이용하여 synthesis를 진행하였고, 합성된 cDNA는 635.2ng/ul, 260/280은 1.63, 260/230은 1.81로 측정되었습니다.

cDNA 측정값을 보고, cDNA가 합성이 잘 되었다고 판단하여 qRT-PCR을 진행하였는데, 아래에 적어둔 것처럼 GAPDH Ct값이 너무 낮게 측정됩니다.....

조직을 이용해서 qRT-PCR을 진행할때는 항상 cDNA 1ug/well로 plate에 넣어주었고, 이번에 isolation을 진행한 kupffer cell에서는 1.6ug/well로 PCR palte에 넣어주었는데, 왜 더 양이 적은 kupffer cell에서 GAPDH Ct값이 더 높게 측정되는지 이유를 모르겠습니다....ㅜ.ㅠ